معرفی روشهای صحیح و نوین ارزیابی اسپرم گاو نر

اسپرم گاوهای نر ممتاز به دو روش اسپرم مایع (سرد) و اسپرم منجمد شده مورد استفاده قرار میگیرد. به علت برخی ویژگیها و مزایا (بارور بودن آن برای بیش از 50 سال) امروزه در صنعت پرورش گاو عمدتا از این اسپرم استفاده می گردد. باروری اسپرم گاو های نر تحت تاثیر عواملی نظیر توارث، سن، نژاد، تغذیه، بیماری، استرس و مدیریت پرورش و اسپرم گیری قرار دارند. این عوامل نقش موثری در شاخصهای کیفی و کمی منی بازی میکند. ممکن است ویژگیهای دینامیکی و مورفولوژیکی اسپرم در دفعات مختلف اسپرم گیری با هم متفاوت باشد. بنابراین جهت تولید اسپرم با باروری بالا در هر دو روش (اسپرم سرد و منجمد)، بایستی تولید کننده با معیارهای درست اصولی ارزیابی و انتخاب منی آگاهی کافی داشته باشد.

ارزیابی ماکروسکوپی:
رنگ منی: بسته به غلظت اسپرم رنگ منی می تواند از کرم تا آبکی متفاوت باشد. اگر میزان اسپرم در منی بیشتر باشد رنگ منی به سمت کرم تمایل داشته و اگر تراکم اسپرم در منی پایین باشد رنگ آن به آبکی متمایل خواهد بود.
حجم و غلظت منی، حجم و غلظت انزال تحت تاثیر عواملی چون ژنتیک، سن، دمای محیط، تغذیه، غلظت اسپرم، استرس، مدیریت و غیره قرار میگیرد. برای مثال در برخی گونه ها مانند گوسفند و بز نسبت به اسب و گاو حجم اسپرم کمتر ولی غلظت بیشتری  دارند. همچنین حجم و غلظت اسپرم با سن رابطه مستقیمی دارد. تاثیر دما بر اسپرم به گونه ای است که در دماهای خیلی پایین (9- درجه سانتی گراد به پائین) و دماهای بالاتر از 35 درجه سانتی گراد (در نژادهای مختلف دامنه دمایی تغییر میکند) می تواند بر حجم اسپرم تاثیر داشته باشد. تغذیه نقش مهم و موثری در حجم و غلظت انزال دارد، چنانچه کیفیت و کمیت خوراک مصرفی حیوان نامناسب باشد، سبب کاهش حجم و حتی غلظت می شود، در حالیکه عکس این حالت نیز صادق می باشد. در حجم اسپرم با غلظت آن رابطه معکوسی وجود دارد، بطوریکه با افزایش غلظت اسپرم حجم آن کاهش می یابد. استرس یکی از علل کاهش حجم اسپرم میتواند باشد. حیوانی که تحت استرس باشد، گرفتن اسپرم آن بسی دشوار است که در نتیجه آن مقدار اسپرم حاصله نسبت به حالت طبیعی کمتر است. هر گونه نقص در امر مدیریت نگهداری گاو نر و همچنین روش صحیح اسپرم گیری تاثیر منفی بر حجم و غلظت اسپرم دارد.
pH منی: در گاو هلشتاین pH حدود 8 / 6 می باشد، pH اسپرم وابسته به زمان می باشد بطوریکه هر چقدر فاصله بین زمان اسپرم گیری و تلقیح، سرد نمودن و یا انجماد بیشتر باشد، بواسطه فعالیت متابولیکی اسپرم و در نتیجه آن افزایش اسیدلاکتیک به محیط منی، pH افزایش می یابد. pH بیشتر از 9 / 6 نشان دهنده کیفیت پایین منی است.

ارزیابی میکروسکوپی:
غلظت اسپرم: به تعداد اسپرم ها در هر میلی لیتر می باشد و با شمارش اسپرم و توجه به رقیق سازی و تعداد اسپرم موجود در هر نمونه تهیه شده بر روی لام هموسیتومتر توسط میکروسکوپ نوری محاسبه می شود. روشهای دیگر برای ارزیابی این پارامتر توسط سیستم اتوماتیکی نظیر CASA یا استفاده از اسپکتوفتومتر میتوان اشاره نمود.
تحرک موجی: این پارامتر ارتباط مستقیم و معنی داری با نرخ باروری اسپرم دارد. برای تعیین حرکت موجی، یک قطره از منی را بر روی یک لام گرم و تمیز قرار داده و سپس با میکروسکوپ نوری با بزرگ نمایی 100 مشاهده میکینم و از صفر (فاقد حرکت موجی) تا 4 (حرکت موجی شدید) نمره دهی می کنیم. ارزیابی توصیفی تحرک موجی بدین صورت می باشد: خیلی خوب (حرکات سریع، قوی مانند گردبادی و چرخش شدید اسپرم ها یا درجه 4)، خوب (حرکات آهسته گردبادی و چرخشی اسپرمها یا درجه 3)، متوسط (حرکت گردبادی و موج دار دیده نمی شود ولی حرکات برجسته انفرادی سلولها دیده میشود یا درجه 2)، ضعیف (هیچ گونه حرکت انفرادی و موجی دیده نمی شود درجه 1).
تحرک پیشرونده: یکی از مهمترین پارامترهای ارزیابی تحرک پیش رونده اسپرم می باشد که همبستگی بالایی با باروری دارد. تحرک پیش رونده اسپرم با دو روش شمارش چشمی و آنالیزگر کامپیوتری اسپرم (CASA) انجام می شود. در روش سنتی ابتدا منی را در سیترات 9 / 2 درصد به نسبت 1 به 100 رقیق نموده و سپس یک قطره از محلول حاصل را بر روی لام گرم (37 درجه سانتی گراد) قرار می دهیم، سپس یک لامل را بر روی آن قرار می دهیم. نمونه تهیه شده را با میکروسکوپ با بزرگنمایی 100 مشاهده می کنیم. از مجموع 200 اسپرم شمارش شده از چند نقطه مختلف لام شمارش شده و بصورت درصد بیان می شود. درصد اسپرم ها با تحرک پیش رونده و سرعت پیشروندگی مطابق معیارهای زیر سنجیده می شود:

پیشروی و حرکت سریع و بسیار زیاد، بطوریکه دیدن سلول بسیار مشکل است (A)، حرکت مداوم پیش رونده با سرعت ملایم (B)، پیشروی آرام به صورت توقف کردن و حرکت دوباره (C)، فاقد حرکت و موج کم یا لرزش دم بدون پیشروی (D). در روش معمولی زمانی که تعداد نمونه ها افزایش می یابد، خطای ارزیابی توسط فرد ارزیابی کننده نیز افزایش می یابد، دستگاه اتوماتیکی CASA بعلت دقت بالای ارزیابی آن چند سالی است که در مراکز تهیه اسپرم استفاده می شود. یک قطره از منی بسیار نازک در بین لام و لامل گرم پخش شده و با بزرگ نمایی 100 مشاهده می شود. آنالیزگر CASA براساس آزمون 25 تصویر دیجیتالی متوالی در ثانیه توسط میکروسکوپی با عدسی بزرگنمایی تصور آن ده برابر و صفحه گرم، حرکت اسپرم ها را شناسایی و آنالیز می کند. دستگاه CASAعلاوه بر تحرک پیشرونده، VCL منحنی خطی سرعت، سرعت خط راست VSL، مسیر سرعت VAP، میزان خطی بودن حرکت اسپرم LIN (نسبت /VCL STR ،(VSL مستقیم بودن حرکت اسپرم (نسبت VAP/VSL WOB)، منحنی خطی میران جنبایی حرکت(نسبت/VAP ALH ،(ACL دامنه تغییر مکان جانبی سر اسپرم را به حسب um / s نشان می دهد. منی که تازه ذوب شده با کیفیت خوب، معمولا دارای تحرک پیش رونده 40 - 50 درصد می باشد. پس از 2 ساعت انکوباسیون این مقادیر به ترتیب 10-15 کاهش می یابد.
حداقل استاندارد مورد نیاز برای تحرک توسط گروه پزشکی و تریوژنولوژی گاو دانشگاه ساسکاچوان کانادا ایزو 9002 بدین صورت می باشد: ساعت صفر=اسپرم هایی با 25 درصد تحرک و 2ساعت بعد=اسپرم هایی با 15 درصد تحرک.

رنگ آمیزی تفریقی اسپرم زنده و مرده:
مطالعات نشان می دهد که ارتباط مستقیمی بین تعداد اسپرم زنده با آبستنی های موفق وجود دارد. بنابراین تشخیص درصد اسپرم های زنده و مرده منی تعیین کننده کیفیت اسپرم ها جهت اهداف تلقیح مصنوعی می باشد. برای تشخیص درصد زنده و مرده اسپرم از رنگ های نظیر ائوزین، نیگروزین و اوپال آبی یا تلفیقی از آنها بکار برده می شود.
ائوزین از این جهت که نمی تواند از غشاهای سلول زنده عبور کند، ولی قادر است از غشاهای سلول مرده عبور کند برای این هدف مناسب می باشد و نیگروزین به عنوان یک رنگ تفریقی ترجیح داده می شود. یک رنگ زمینه ای نظیر اوپال آبی به قابل رویت شدن سر اسپرم هایی که رنگ نشده اند کمک می کند. درصد اسپرم های زنده در یک نمونه منی به عنوان آزمایش تحرک مورد استفاده قرار می گیرد.
البته باید بخاطر داشت که درصد اسپرم های زنده همیشه اندکی بیشتر از درصد متحرک است.

روش تهیه نمونه رنگ آمیزی اسپرم با ائوزین-نیگروزین جهت تعیین درصد اسپرم های زنده و مرده:
زنده مانی اسپرم، مورفولوژی و آکروزوم غیر نرمال با مشاهده میکروسکوپی منی های رنگ آمیزی شده با رنگ انوزین-نیگروزین ارزیابی می شوند. روش انجام آن بدین صورت است که یک قطره (حدود 10 میکرولیتر) منی خالص را روی یک اسلاید از پیش آمده شده (بروی پلیت داغ با دمای 37 - 36 درجه سانتی گراد) به دو قطره ازرنگ ائوزین – نیگروزین اضافه می گردد. نمونه منی هم دما با ائوزین – نیگروزین بطور ملایم مخلوط شده و توسط یک اسلاید دیگر نمونه تهیه شده را روی اسلاید دیگر پخش می گردد. تشخیص زنده مانی اسپرم، آکروزوم و مولوژی غیر نرمال توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 1000 با کمک روغن امرسیون انجام می شود. از مجموع 200 اسپرم شمارش شده درصد اسپرم های زنده، آکروزوم غیر نرمال و ناهنجاری محاسبه می شود. باید توجه داشت اسپرم هایی که قسمت کوچکی از سر یادم آنها رنگ جذب کند در شمارش آنها را به عنوان اسپرم مرده محاسبه می شود. روش دیگر ارزیابی غیر نرمال بودن آکروزوم فیکس نمودن با گلوتارآلدهید 2 / 0 درصد و مشاهده با میکروسکوپ فاز کنتراست می باشد. همچنین برای مرفولوژی، می توان از رزبنگال استفاده شود و اسپرمهای صورتی را به عنوان اسپرم مرده شمارش نمود. اسپرم های غیر زنده رنگ آمیزی می شوند. غیر نرمال بودن به دو کلاس اولیه و ثانویه تقسیم بندی می شود.
ناهنجاری اولیه در طول اسپرماتوژنسیز بیضه ها و ناهنجاری های ثانویه در اپیدیدیم و محیط فرآوری منی بوجود میاید. بطور معمول حداکثر اسپرم های با سر غیر نرمال در هر انزال بین 15 تا 20 درصد قابل قبول می باشد. آکروزوم و دم غیر نرمال تا 25 درصد قابل قبول می باشد. در هیچ موردی اسپرم های نرمال نباید کمتر 70 درصد در هر انزال یک گاونر باشد.

ویژگیهای منی گاو بارور:
تحرک پیشرونده بیش از 70درصد، غلظت بیش از 500 میلیون در هر میلی لیتر، اسپرم زنده بیش از 50 درصد، سر غیر نرمال کمتر از 20 درصد (بین 12 - 8 درصد نرمال می باشد)، قطره سیتوپلاسمی پروکسیمال کمتر از 4درصد، قطره سیتوپلاسمی دیستال کمتر از 4درصد، قطعه میانی غیرنرمال کمتر از 15 درصد، دم دوتایی کمتر از 4 درصد و دم کج کمتر از 3 درصد.
تعیین درصد آکروزومهای سالم: یک روش مورفولوژی برای سنجش زنده مانی بعد از ذوب می باشد که با باروری مرتبط می باشد.
تعیین میزان زنده مانی و قابلیت باروری منی منجمد معیار با ارزشی است که به شاخص تحرک افزوده می شود. برای ارزیابی آکروزوم بایستی حرکت اسپرم متوقف شود. این روش با مخلوط نمودن منی با بافرگلوتارآلدئید 2 / 0 درصد که غشاء را برای مافیکس کرده و از آسیب های پیایند بر اسپرم محافظت می کند، صورت می گیرد. 200 سلول اسپرم با بزرگنمایی 1000 به همراه روغن امرسیون بلافاصله بعد از یخ گشایی منی و پس از انکوباسیون ارزیابی می شود. حداقل مقادیر قابل قبول بدین صورت می باشد: ساعت صفر=50 درصد آکروزومها سالم و 2 ساعت بعد=35 درصد آکروزوم ها سالم.

نتیجه گیری
تلقیح مصنوعی موفق منوط به تعداد قابل قبولی از اسپرم زنده، متحرک و با مورفولوژی طبیعی و نهایتا بارور می باشد. کیفیت و کمیت منی بشدت تحت تاثیر عوامل محیطی است که در این خصوص منی در محیط خارج از بدن دام می تواند تحت تاثیر استرس محیط قرار گیرد. بنابراین فراهم نمودن شرایط نگهداری منی در حیط خارج از بدن نظیر شرایط داخل بدن حیوان نر امری ضروری می باشد تا آثار زیانبار انواع استرس بر منی جلوگیری کنیم. اثرات زیانبار محیطی می توانند از ناهنجار نمودن اسپرم تا کاهش باروری و نهایتا مرگ اسپرم را دربر گیرد. جهت تولید اسپرم هایی با حداکثر باروری بایستی هر یک از مراحل عمل آوری منی (رقیق کردن، خنک کردن، بسته بندی و انجماد) با دقت هر چه بیشتر انجام شود.
برای ارزیابی های قبل و بعد از انجماد اسپرم استانداردهایی تعریف شده است که رعایت آن در کنترل مراحل مختلف فرآوری منی از اهمیت ویژه ای برخوردار است، که بطور خلاصه در ذیل آمده است.
کنترل کیفیت اسپرم قبل از یخ گشایی: تحرک پیشرونده <70 درصد، غلظت< M1500، اسپرم زنده<50درصد، ناهنجار، >10-12درصد؛ کیفیت منی بعد از یخ گشایی با دمای یخ گشایی 37 درجه سانتی گراد، تحرک پیش رونده انفرادی<40درصد، اسپرم با مرفولوژی نرمال<70، آکروزوم سالم< 60درصد، حداقل اسپرم های زنده 40 درصد.

 

رستگار الفتی کرجی - استادیار ژنتیک تولید مثل گروه علوم دامی دانشگاه تبریز  

دکتر حسین دقیق کیا - دانشجوی کارشناسی ارشد فیزیولوژی گروه علوم دامی دانشگاه تبریز