بررسی نقش متابولیکی و شناسایی میکروب های شکمبه با تکنیک real time PCR

بررسی نقش متابولیکی و شناسایی میکروب های شکمبه با تکنیک real time PCR
در کشورهای منطقه استوایی جهان، نشخوار کنندگان با محصولات فرعی کشاورزی لیگنو سلولزی مانند، کاه غلات، علوفه، باگاس نیشکر، شاخ و برگ درختان و دانه های روغنی مانند بادام زمینی، کتان، mohua، neem و خردل تغذیه می شوند. بازدهی حیوانات نشخوار کننده در استفاده از این دامنه وسیع مواد خوراکی به علت تنوع بالای اکوسیستم میکروب های شکمبه است که شامل باکتری ها (1011-1010 سلول در هر میلی لیتر، 50 بیش از جنس)، پروتوزا مژه دار (106-104 در هر میلی لیتر، از 25 جنس)، ‌قارچ های بی هوازی (105-103 زعو سپور به ازاء هر میلی لیتر، از 5 جنس) و باکتری خوارها (109- 108 به ازاء هر میلی متر) می باشد. بیشتر این تعداد قابل تغییر می باشد. خاصیت سینرژیستی و آنتاگونیسمی در میان گروه های مختلف میکروب ها و حتی در میان جنس های مختلف از یک گروه یکسان وجود دارد. بنابراین تعیین نقش هر یک از میکروب های موجود در شکمبه را پیچیده و مشکل می سازد. نتیجه نهایی واکنش های انجام شده در شکمبه، تبدیل زیستی خوراک به منبع انرژی (اسیدهای چرب فرار زنجیر کوتاه) است. که برای حیوان قابل استفاده می باشد، این میکروب ها در شکمبه تحت تاثیر محدودیت های مختلف زنده می مانند که این محدودیت ها ممکن است طبیعی یا مرتبط با خوراک باشند بنابراین مقداری از خوراک ها به طوریکه بعضی از خوراک دارای مقادیر قابل توجهی مواد ضد تغذیه ای هستند، که این فاکتور ها رشد برخی از میکروب های طبیعی شکمبه را محدود می کنند.
اکوسیستم میکروبی شکمبه در عین حال که زمان پویا، پایدار می باشد. زمانی که اکوسیستم پایدار در شکمبه بر قرار شود و عمل تبدیل زیستی خوراک ها به اسیدهای چرب فرار به خوبی انجام می شود. در یک نشخوار کننده سالم با وجود اینکه میلیون ها میکروب هر روز شکمبه را به واسطه غذا، نوشیدن آب و هوا مورد حمله قرار می دهند آلودگی اکوسیستم اتفاق نمی افتد. اکوسیستم پویا است حیوان جمعیت میکروب ها به طور قابل ملاحظه ای بر اثر تغییرات جیره تغییر می کند، به این دلیل  که با اجزاء جدید خوراک سازگاری ایجاد گردد این امر اتفاق می افتد، زیرا میکروب های شکمبه برای بقا با یک سری از محدودیت های شایع در شکمبه و هر جسم آلوده کننده ای باید سازگاری پیدا کنند، در غیر این صورت این محدودیت ها باعث حذف آنها می شود. محدودیت های اصلی محیطی زیاد هستند، از جمله آن ها می توان به شرایط هوازی، ظرفیت بافری بالا و فشار اسمزی و رقابت saprophytic در میان میکروب ها برای بقایشان اشاره کرد. بی هوازی بودن محیط شکمبه یک محدودیت بزرگ در اکوسیستم شکمبه است، که به تبدیل انرژی و  استفاده از آن توسط حیوان میزبان کمک می کند. میزان انرژی آزاد شده توسط فرآیند انتقال الکترون به گیرنده نهایی الکترون بستگی دارد. در میکروب های هوازی، آخرینگیرنده ی الکترون اکسیژن است و انرژی آزاد شده به شکل ATP می باشد و در مقایسه با انرژی آزاد شده در باکتری های غیر هوازی که گیرنده نهایی الکترون یک ترکیب آلی است بسیار بیشتر می باشد. شرایط بی هوازی در شکمبه بوسیله گازهای تولید شده در طی تخمیر، به عنوان دی اکسید کربن، متان و مقدار ناچیز هیدروژن حفظ می شود. مقداری از اکسیژن که از طریق مصرف خوراک  وارد شکمبه می شود بوسیله میکروب های غیر هوازی اختیاری در شکمبه مورد استفاده قرار می گیرند بنابراین شرایط بی هوازی کامل تولید و نگهداری می شود. به هر حال، میکروب هایی که قادر به تحمل  چنین پتانسیل احیاء پایینی هستند (350 – میلی وات) قادر به زندگی در شکمبه هستند و بقیه از شکمبه حذف می شوند. ظرفیت بافری بالا و فشار اسمزی نیز رشد و حمله میکروب ها را محدود می کنند. تعدادی از میکروب های شکمبه یکسری ترکیبات ضد میکروبی تولید می کنند که موجب کاهش رشد دیگر میکروب های حاضر در اکوسیستم شکمبه می شوند. نشخوارکنندگان عمدتا با محصولات فرعی کشاورزی- صنعتی تغذیه می شوند، این محصولات حاوی فاکتورهای ضد تغذیه ای زیادی هستند و می توانند بعنوان مهارکننده برای تعدادی از میکروب های شکمبه عمل کنند. ترکیبات ضد تغذیه ای مانند تانن ها، لیگنین ها، ساپونین ها، میموزین ها و غیره در گیاهان سنتز می شود. برای اینکه آنها را در برابر حمله میکروب ها حفظ کنند. به هر حال این ترکیبات دارای فعالیت ضد میکروبی هستند. زمانی که این گیاهان توسط حیوانات مصرف می شوند، این ترکیبات رشد انواع مختلف میکروب ها (مفید و نامطلوب) در شکمبه را محدود می کنند.

تکنیک های مولکولی برای شناسایی میکروب های شکمبه
همان گونه که در بالا بحث شد، اکوسیستم میکروب های شکمبه پیچیده است  و مسعول تبدیل زیستی خوراک های لیگنو سلولزی به اسیدهای چرب فرار می باشد، به هر حال وظیفه ویژه هر یک از  میکروب های اختصاصی شکمبه مهم است همان طوری که رقابت در بین میکروب های اکوسیستم برای بقا مهم است. تعیین تعداد گونه خاص از باکتری ها در اکوسیستم (برای تعیین نقش آنها در تخمیر شکمبه ای) با تکنیک ها معمول و سنتی مشکل است چون تعداد زیاد تست های بیوشیمیایی انجام می گیرد و حتی در مورد بعضی از میکروب های غالب موجود در اکوسیستم شکمبه دقت کافی وجود ندارد. این ممکن است به دلیل فشار انتخاب محیط کشت استفاده شده برای شمارش میکروب ها باشد چون تعداد نسبی این میکروب ها زمانی که در یک پتری دیش کشت داده می شوند در مقایسه با فعالیت متابولیکی در اکوسیستم تغییر خواهد کرد.  علاوه بر این، بخش خیلی زیادی از میکروب های شکمبه غیر قابل کشت می باشند، اما در تخمیر شکمبه ای فعال هستند. به هر حال، برای تحقیق به تعدادی تکنیک بهتر به منظور تشخیص کمیت میکروب های ویژه در این اکوسیستم ضروری است، که بتواند اشکالات نامبرده شده از تکنیک های معمول و سنتی مطالعه اکولوژی میکروبی شکمبه را رفع کند. تعداد زیادی از باکتری هایی که در شکمبه حضور دارند غیر قابل کشت هستند به طوری که تعداد کل باکتری های زنده بر روی یک محیط کشت خاص نسبت به شمارش میکروسکوپی باکتری ها به میزان زیادی کمتر است. یک محیط کشت واحد قابل دسترس وجود ندارد که بتواند رشد تمام باکتری های قابل کشت شکمبه را حمایت کند. به هر حال، اطلاعات موجود در مورد باکتری های قابل کشت شکمبه کامل نیست. طبقه بندی باکتری های شکمبه بر پایه ویژگی های فنوتیپی و تست های بیوشیمیایی برای مطالعه تنوع میان ارگانیسم های زنده قابل کشت کافی نمی باشد. مطالعات روی بیولوژی مولکولی جنس های شناخته شده  باکتری های شکمبه نشان می دهد که Prevotella ruminicola ، Butyribirio fibrisolvens و Ruminococus بیان کننده تکامل نژادی گروه های مختلف باکتری ها می باشند، علی رغم این حقیقت که گونه های از این جنس ها از نظر فنوتیپی و بیوشیمیایی شبیه هستند. مطالعه معمول و سنتی جداسازی و توصیف میکروب های قابل کشت شکمبه مشکل است چون با تغییر جیوه تنوع زیادی در گروه های مختلف میکروب های شکمبه ایجاد می گردد.
به هر حال، یک چنین تنوعی در تعداد باکتری های شکمبه می تواند با بکارگیری پروب های DNA الیگونوکلئوتیدی مختلف،  هومولوگ های برای برخی از 16S rRNA باکتری ها مطالعه شود. پروب کلی می تواند برای  تخمین کل توده میکروبی بکار گرفته شود و یک پروب مخصوص گونه می تواند به منظور تخمین سهم نسبی کل rRNA از یک گونه باکتری های خاص استفاده شود. همان طور که نسبت 16S rRNA به کل RNA سلولی برروی منحنی رشد تغییر نمی کند، 16S rRNA می تواند به عنوان یک معیار جمعیت کل باکتریایی در شکمبه استفاده شود. پروب های DNA خاص می تواند همچنین بکار برده شود برای یک گونه باکتریایی واحد در یک جمعیت مخلوط بکار گرفته شود به شرطی که تراکم باکتریایی مربوطه بیش از ده میلیون سلول در هر میلی لیتر از محتویات شکمبه باشد. تاجیما و همکاران  پرایمرهای PCR را برای تشخیص 13 گونه از باکتری های شکمبه طراحی کردند و این پرایمرها را به روش PCR real time برای تعیین تعداد باکتری ها در اکوسیستم میکروبی شکمبه مورد استفاده قرار دادند. این گروه در دانشگاه ایلینویز آمریکا، برای اولین بار PCR  real-time را در اکولوژی میکروبی شکمبه به کار بردند و مشخص کردند که این روش می تواند یکی از مهمترین تکنیک هایی باشد که برای مطالعه تنوع در تعداد نسبی میکروبی ناشی از تغییرات جیوه استفاده می شود، از طرفی برای مطالعه استقرار گونه های بهبود یافته از باکتری های ویژه در شکمبه هم می توان از این تکنیک استفاده کرد. به علاوه، این سری از پرایمرها برای شناسایی اولیه باکتری های جدید جدا شده از شکمبه حیوانات اهلی و وحشی می تواند کاربرد داشته باشد. این تکنیک های جدید ممکن است همچنین به فهم مکانیسم استفاده از غذا در شکمبه کمک کند. تا سال های اخیر تصور می شد که در شکمبه به حیوانات تغذیه شده با جیره غنی از نشاسته، باکتری استرپتوکوکوس بویس (Streptococcus bovis) به عنوان باکتری استفاده کننده از نشاسته غالب می باشد، اما مطالعات با Real time PCR نشان داد که تعداد Streptococcus bovis در زمان تغییر جیره از پایه علوفه به کنسانتره در اکثر حیوانات تحت تاثیر قرار نمی گیرد ولی به جای آن باکتری استفاده کننده از اسید لاکتیک یعنی Megasphaera elsdenii افزایش می یابد و در نتیجه آن در شکمبه غلظت لاکتات کمتر و پروپیانات بیشتر می شود. برای هیدرولیز نشاسته میکروب های دیگری ممکن است فعال شوند. به هر حال، به نظر می رسد که با استفاده از تکنیک های بیولوژی مولکولی جدیدتر، نقش متابولیکی مطرح شده برای گروه های مختلف باکتریایی تغییر کند و در سال های جدید سناریوی میکروبیولوژی شکمبه به طور کامل دچار تغییر و دگرگونی خواهد شد.

منابع:

1. Hobson, P. N., The Rumen Microbial Eco-system, Elsevier Applied
Science, London, 1989.

2. Thauer, R. K., Jumgermann, K. and Decker, K., Energy conservation
in chemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriol. Rev., 1977,
91, 100–180.
 
3. Stewart, C. S., Duncan, S. H. and Richardson, A. J., The inhibition
of fungal cellulolysis by cell free preparations from ruminococci.
FEMS Microbiol. Lett., 1992, 97, 83–88.
 
 
نظر خود را ثبت نمایید
Copyright © 2006 - 2019 ITPNews.com