توسعه تشخیص سریع و خصوصیات ژنتیکی سالمونلا در خوراک طیور تولید کننده

مقدمه:
سالمونلا یک عمده بیماری برخواسته از خوراک در ایالات متحده است. در 29% از عفونت های سالمونلایی ، و یا در حدود 406،000 مورد سالانه ، مرغ به عنوان منبع اولیه عفونت شناخته شده است. هزینه های غیر مرتبط با عفونت های سالمونلای تقریباً 2،4 میلیارد دلار در سال است ، که به علت هزینه از دست دادن بهره وری و هزینه های درمان پزشکی تخمین زده می شود. خسارات ناشی از عفونت سالمونلا یک تولید کننده مرغ شامل از دست دادن پرندگان و زمان تولید می باشد. این تلفات در ایالات متحده آمریکا در هر سال تا حدود 64 میلیون نفر 114 میلیون دلار محاسبه شده، اما این محاسبه باید به زیان از دست دادن تخم مرغ و دیگر محصولات مصرفی مرغ اضافه می شود.
استفاده از آنتی بیوتیک برای کنترل سالمونلا در طیور انتخابی مناسبی نیست. گزینه های دیگری نسبت به استفاده از آنتی بیوتیک برای کنترل باکتری در مرغ است که از جمله آنها باکتری خوار و پروبیوتیکها هستند که به طور کامل موفق آمیز بوده اند. اگر یکی از پرندگان در یک گله با سامونلا آلوده می شود ، عفونت می تواند به سرعت گسترش یافته و کل گله می تواند در ظرف 2 تا 10 روز آلوده شود. سالمونلا از آنجا که ممکن است در محیط بین گله ها باقی بماند، کنترل عفونت در ابتدا می تواند کمک به کاهش و رفع آلودگی محیط زیست شود. از این رو، نظارت مستمر و تشخیص سریع برای جلوگیری از عفونت سالمونلا در گله های مرغ مورد نیاز است.
ممکن است سالمونلا در یک گله توسط منابع مختلف از محیط زیست وارد شده ، اما خوارک مرغ به عنوان مظنون اولیه است. تشخیص سالمونلا در خوراک به خاطر پایین بودن سطح باکتری و عدم کارایی و توانایی استفاده از روش های کشت سنتی می تواند به چالش کشیده شود. روش های تشخیص بسیاری را در طی سال ها برای تعیین کیفیت و کمیت سالمونلا در خوراک بررسی شده و در بسیاری از خوراکها برای جدا سازی و تشخیص سالمونلا موثر استفاده شده است. با این حال ، با توجه به پتانسیل لازم برای افزایش حساسیت تشخیص ، فن آوری های تشخیص مولکولی ممکن است نامزد بهترین روش برای توسعه سریع و حساس تشخیص سطوح پایینی از سالمونلا را دراین زمینه از حجم زیادی از مواد خوراکی را داشته باشند.
مشکل اصلی دراستفاده از روال آزمایشات مولکولی مشکل استخراج و نقاهت نمونه گرفته شده از خوراک در تجزیه و تحلیل مولکولی است. تکنیک های مولکولی نیز ممکن است به دلیل وجود مواد شیمیایی موجود در نمونه خوراک مانع انجام صحیح واکنش PSR شود. در این مقاله فرآوری خوراک و نقاط بالقوه در این روند که ممکن است آلودگی سالمونلایی خوراک را موجب شود مورد بحث و بررسی قرار می گیرد. روش های تشخیصی که در حال حاضر استفاده می شود و نیاز به پیشرفت در این روش نیز بحث خواهد شد. آرایه های دانه تسبیح بر اساس دی ان ای و از این نوع نوآوری ها برای تشخیص همزمان سروتیپ های متععد سالمونلا به ارائه امکانات جدید برای تشخیص سریع منجر شده است. در نهایت ، اجرای تشخیص سریع برای بهینه سازی روش کنترل جهت جلوگیری و رفع هر گونه آلودگی سالمونلایی از خوراک در نظر گرفته خواهد شد.
سالمونلا در گله مادر گوشتی
زمان زیادی است که به رسمیت شناخته شده که گله ای مرغ مادر از نقش حیاتی در کنترل انتشار عفونت و آلودگی سالمونلا برخوردارند . جوجه به دنیا آمده در محل جوجه کشی به دلیل عدم وجود میکروفلور محافظ روده بیشتر در معرض عفونت با سامونلا هستند. به همین دلیل ، جوجه های یکروزه را می توان حتی با 5 سلول لز سالمونلا آلوده ساخت، اما بیمار شدن پرندگان با سن 2 هفته که از میکروفلور برخوردارند نیاز به دوزهای بالاتر است. علاوه براین ، حساسیت این بیماری در جوجه های جوان در انتقال سریع افقی آن می باشد. آمارگیری ها و پیش بینی های نشان دهنده و جود سالمونلا در جوجه ها در محدوده جوجه کشی از 4،8 تا 9% است.
جوجه آلوده گرفته شده از جوجه کشی در مزرعه پرورش قرار می گیرد می تواند به عنوان منابع عفونت و آلودگی محیط زیست مزرعه باشد نشان داده شده است که سالمونلا در محیط مزرعه برای مدت 1 سال با یا بدون مرغ می تواند پایدار بماند. علاوه براین ، در مجموع ضدعفونی کردن کامل مزارع پرورش ،غیر ممکن می باشد از آنجا که برای دستیابی به محیط زیستی پاکیزه و تمیز مشکلاتی مانند موش و پرورش پرندگان وحشی وجود دارند.
آلودگی سالمونلا در مزارع پرورشی می تواند از منابع مختلف در محیط زیست مانند خوراک ، ترکیبات خوراک ، آب ، کود و گله های مادر از آمده باشد. با این حال ، برای تعیین و کنترل منابع سالمونلا گله های مادر با ارزش تر از دیگر گله های مرغ هستند و به همین دلیل نیاز به جوجه کشی در گله های مادری ، از- هنر قابل توجهی جهت طراحی از حرکتی کثیف به تمیز به منظور کاهش آلودگی می باشد. بروز مشکل معمولا در جوجه کشی های تولید کننده جوجه گوشتی معین است.
در گله های مادری کوچکتر، تخم مرغ جوجه کشی شده متناوباً جمع آوری شده و ضدعفونی در مدت کوتاهی پس از جمع آوری انجام می شود . خوراک به عنوان یک منبع مهم سالمونلا در مرغ به حساب می آید . تکنیک های مدرن کشت نیاز به غنی سازی به منظور شناسایی چنین تعداد کم سلول است. روش های مولکولی به اندازه کافی حساس به کشف اعداد چنین کمی نیستند . به همین دلیل ، برخی از آلودگی های سالمونلا خوراک ممکن است شناسایی نشوند. منابع سالمونلا و فرآوری خوراک در بخش بعد مورد بحث قرار خواهد گرفت.
خوراک
پیشنهاد شده که وقوع آلودگی سالمونلا در خوراک و در تولید آن ممکن است به دلیل سالمونلا انتقال یافته از پرندگان وحشی ، جوندگان و آفات دیگر باشد. علاوه براین ، آلودگی خوراک می تواند از آسیاب مواد مصرفی که حاوی فضله پرندگان وحشی باشد در خوراک به وجود آید. پلت و دان آردی از دیر باز به عنوان شاخصه ای جهت آلودگی سالمونلایی در سیستم های تولید و پرورش مرغ با مواد تشکیل دهنده از منشاء جانوری با بالاترین میزان وقوع آلودگی به رسمیت شناخته شده است. با این حال ، مواد تشکیل دهنده منشاء گیاهی نیز آلوده گزارش شده است،  از آنجا که خوراک زنجیره اول در مراحل ایمنی مواد غذایی تولیدات مزرعه به مصرف کننده است ، نشان دهنده یک نقطه بحرانی برای مداخله و کنترل سالمونلا می باشد.
منابع سالمونلا خوراک Morris و همکاران گزارش کردند در نمونه برداری از تمام نمونه های خوراک یک گله تجاری ، اغلب با سالمونلا آلوده بودند. شیوع سالمونلا در خوراک انسان به دهه های گذشته بازمیگردد. در سال 1958 ، شیوع عفونت سالمونلا از سویه Hadar . s در اسرائیل به مصرف جگر مرغ مرتبط بود که در نهایت به پودر استخوان مورد استفاده در تغذیه جوجه باز می گشت . مرغ منجمد بسته بندی کارخانه در شهر Cheshire ، انگلستان عامل شیوع گسترده عفونت سالمونلا با سویه S. Virchow در سال 1968 بود. این تحقیق نشان داد که محل جوجه کشی و برخی از مزارع پرورش پشتیبان کارخانه بسته بندی آلوده به سویه .S. Virchow بودند. در این تحقیق ، سروتیپ سالمونلا از دان خورانده شده جوجه جدا شده بود. جوجه مصرفی در یک رستوران در آرکانزاس باعث وقوع .S. Agona شد. جوجه ها از یک مزرعه در میسی سی پی که مرغ آن با دان حاوی پودر ماهی پرو آلوده به سویه S. Agona تغذیه شده بودند آورده شده بود. پودر ماهی منبع نهایی و اصلی برای عفونت سویه S. Agona در ایالات متحده ، بریتانیا ، اسرائیل ، و هلند معلوم شد. بیشتر تحقیقات اخیر با استفاده از روش های پیچیده تعیین ژنوتیپ تایید کرد که سالمونلا خوراک می تواند یک منبع اصلی آلودگی باشد . فرآوری خوراک دان معمولا شامل ذرت ، سویا ،یونجه ، کلسیم و مخلوط ویتامین است  این ترکیب ممکن است بسته به کارخانه سازنده و نوع تغذیه ای که مرغ می شود متفاوت باشد. به عنوان مثال ، مرغ تخمگذار نیاز غلظت های بالاتری از کلسیم برای تولید تخم مرغ و پوسته دارند. برای تولید خوراک مواد تشکیل دهنده مخلوط شده و با بخار فرآوری می شوند. پس از فرآوری خوراک ممکن است با گذر از یک واحد خنک کننده با هوا سرد شده و یا قبل از خنک شدن پلت زنی شوند. Himathongkham نشان داد که رطوبت دان و زمان تغییر حالت دو عامل هستند که نقشی حیاتی در روند پلت زنی برای کشتن باکتری دارند. اغلب مطالعات توافق دارند که فرآیند پلت زنی موثرترین راه در کاهش آلودگی سالمونلا است. کاکس گزارش داند که 92% از نمونه های خوراک آردی آلوده سالمونلا بودند اما نمونه های پلت مثبت نبود. با این حال ، veldman 21% از دان آردی و 1,4 درصد از خوراک پلت آلوده به سالمونلا بودند. به طور مشابه آن‌ ، جونزمولفان. اعلام داشتند 8,8% از نمونه های دان آردی و 2,4 درصد از نمونه های خوراک پلت آلوده به سالمونلا آلوده بودند.اگر در طول درمان حرارتی سالمونلا نابود شود ، باز هم احتمال آلودگی مجدد وجود دارد.مواد تشکیل دهنده خوراک خام می تواند به عنوان یک منبع آلودگی در محیط زیست و در نهایت محصول نهایی خوراک باشند. Veldman نمونه اولیه و مواد تشکیل دهنده خوراک را آزمایش کردهو 130 نمونه از پودر ماهی (31%) ، 83 نمونه از پودر گوشت و استخوان (4 درصد) ، 58 نمونه از نشاسته کاساو یا مانیوک (2%) و 15 نمونه از نخاله ذرت (27%) دارای نتیجه مثبت سالمونلا بودند. اطلاعات ارائه شدهتوسط جونزمولفان. نشان داد که گرد و غبار در درون دستگاه های تولید خوراک می تواند به عنوان یک منبع عمده آلودگی محصول نهایی خوراک به شمار آیند. این نویسنده پیشنهاد کردکه ارتعاشات مکانیکی و جریان هوا در اطراف ماشین های پلت زنی ممکن است گلوله های ذرات گرد و غبار را جمع کرده و باعث فرود آنها در خوراک پلت نهایی شوند. دیویس وwray  نشان داد که واحد های خنک کننده محل کلونی سالمونلایی است. علاوه براین ، امکان آلوده شدن خوراک در طول حمل و نقل و یا انبار کردن آن وجود دارد. در بخش بعد به روش های تشخیص موجود در دسترس و امکانات را برای پیشرفت آینده توضیح می دهیم.
تشخیص
مفاهیم عمومی تشخیص سالمونلا در خوراک می تواند به علت تعداد کم سلول های موجود در یک حجم زیادی از خوراک به چالش کشیده شود. رایلی تخمین نرخ آلودگی خوراک را از طریق عبور از یک کولر آلوده که در هر10 تا 100 هزار تن یم سالمونلای زنده وجود دارد به شرطی که امکان آلوده بودن خوراک اولیه وجود نداشته باشد را محاسبه کرد. در چنین سطح آلودگی ، چالش هم طراحی یک برنامه نمونه برداری دقیق و هم روش تشخیصی است که می تواند یک سلول را در 10 هزار تن از خوراک کشف نماید. عوارض جدا سازی سالمونلا از خوراک نه تنها به پایه توزیع غیره یکنواخت ارگانیسم ها در داخل نمونه ها پیشنهاد شده است ، بلکه از اثرات استرس روی ارگانیسم ها که تحت درمان های مورد استفاده در فرآوری ها محصولات کارخانه خوراک انجام می شود نیز بستگی دارند. علاوه براین در استفاده از فرمالدئید در خوراک می تواند تداخل در روش های تشخیص ایجاد کرده و در نتیجه جواب آزمایشات تشخیص را منفی کاذب نشان دهد. روش های تشخیص بسیاری برای شناسایی سالمونلا مانند کشت ، روش ایمنولوژیکی و روش اسید نوکلئیک توسعه یافته است در صورتیکه تمایل به شناسایی و تعیین خصوصیات سالمونلا باشد، جدا سازی توسط کشت برای تعیین ژنوتیپ ، تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی ، تعیین سروتیپ و یا دیگر خصوصیات انجام می شود. با این حال، اگر تنها حضور و یا عدم حضور ملاک باشد تشخیص به روش اسید نوکلئیک کافی است. هر روش دارای مزایا و معایب و برخی از محدودیت ها است. بخش های بعدی به روش های مجود و بحث و تشریح کاستیها و مزایای استفاده از یک آزمایش خاص در خوراک گله های مادر می پردازد.
کشت میکروبی :
روش های سنتی و کشت میکروبیولوژیکی برای تشخیص سالمونلا در خوراک شامل غنی سازی انتخابی و گزینشی و یا کشت تفرقی است. روش های کشت برای تشخیص سالمونلا مورد بررسی قرار گرفته است. به طور کلی ، کشت آگار حاوی یک نشانگرPH و لاکتوز است که به تفکیک سالمونلا (تخمیری) از باکتری غیر تخمیری می پردازد. از آنجا که اکثر سالمونلا ها تولید هیدروژن سولفید را دارند، می تواند با افزودن ترگتول به محیط نتایج حاصل از رنگ کلونی سالمونلا را عطف به سیاه نمود. سایر عوامل انتخابی ممکن است از قبیل آنتی بیوتیک ها مانند novobicin باشد که اجازه رشد سالمونلا را در حالی که مهار کننده میکروارگانیسمها رقابتی اضافه شده را می دهد. محیط کروموژنیک با استفاده از آنزیم سوبسترا که پس از آب کافت(هیدرولیز) رنگی از خود آزاد می سازد ، و در نتیجه کلونی سالمونلا را رنگی متفاوت داده که به راحتی از فلور دیگر شناسایی می شود. این نوع از آگار دارای یک ویژگی بیش از روش های متعارف است. صرف نظر از محیط کشت مورد استفاده روش های کشت اغلب به عنوان ( استاندارد طلایی ) در نظر گرفته شوند ، اما هزینه اصلی صرف وقت است که در آنها نیاز به روزها انتظار جهت مشخص شدن نتایج است. با توجه به اینکه عفونت در یک گله می تواند در کل ، در مدت سه روز کاملاً پخش شود، نیاز به یک روش تشخیص سریع تر از کشت می باشد تا اقدامات لازم برای پیاده سازی کنترل و جلوگیری از گسترش هر بیشتر عفونت سریعتر انجام گیرد.
جنس سالمونلا فقط دارای دو گونه ، S. bongori , S. enterica و بیشتر از 2500 سروتیپ است، سروتیپ ها دارای 47 O آنتی ژن (دیواره سلولی لپیوپلی ساکاریدی) و 60 نوع ممکن H آنتی ژن (فلاژلوم) که هر یک خود ترکیبی منحصر به فرد از آنتی ژنهای H,O هستند می باشند.
سرم شناسی و lmmunoassys
نام هر یک از سروتیپ ها بر اساس سندرم نمایش داده شده ، ویژگی میزبان و یا موقعیت جغرافیایی نامگذاری شده است هر یک از سروتیپ های سالمونلا ممکن است به طور گسترده ای در ویژگی هایی از قبیل شدت بیماری ، خواص زهراگینی ، توانایی تولید کلونی در جوجه ها و بقا در محیط زیست در خارج از بدن میزبان متفاوت باشند. به همین دلیل ، شناسایی گونه لازم است. علاوه براین ، اطلاعات سروتیپ ها توسط دولت محلی و بخش بهداشت جهت شناسایی محلی‌ ، منطقه ای و ملی سالمونلا مورد استفاده قرار می گیرد. آزمایشات مربوط به سرم شناسی براساس ایمنولوژی مانند الایزا به دلیل تشخیص حساس و خاص به طور گسترده ای برای تشخیص سالمونلا استفاده می شود.با این حال در آزمایشات ایمونولو‍ژیکی به شکل آرایه های چند هدفی به دلیل سطخ بالای برخورد و واکنش ها بین آنتی بادی های، محدودیت در تعداد هدف قابل شناسایی در همان آرایه یکسان شناسایی را دارند.
نتیجه گیری
با افزایش مصرف غذاهای مشتق شده از حیوانات تعدادی از بیماری های مرتبط با خوارک طیور نیز در سال های اخیر افزایش یافته است. ایمنی پرورش طیور بسیار سریع و حساس توسط سیستم تشخیص پاتوژن بهبود خواهد یافت. توسعه میکرو آرایه های دانه تسبیحی DNA توأم با سیتوتری و PCR که برای تشخیص همزمان و افتراق سروتیپ های سالمونلا که عموما با آلودگی خوراک طیور مرتبط می باشد ایده آل است. از مزایای استفاده از میکرو آرایه های دی ان ای می توان به سادگی و قابلیت تسهیم ، مقرون به صرفه بودن و حساس بودن این فناوری اشاره کرد. این تکنولوژی بسیار عملی بوده و به آسانی می تواند در انواع دیگر خوراک ها و ترکیبات آنها اعمال شود.