چکیده
ایمنی مخاطی نقش مهمی در برابر عفونت نیوکاسل دارد. در طیور طبیعی و سرکوب شده ، که با سویه زنده لاسوتای ویروس نیوکاسل به روش قطره چشمی _ بینی در سن سه هفتگی، واکسینه شدند پس از بیست وهشت روز از زمان واکسیناسیون با سویه حاد ویروس نیوکاسل مورد چالش قرار گرفتند و ایمنی مخاطی در آنها بررسی گردید. مهار ایمنی در طیور بوسیله سیکلو فسفامید انجام گرفت. در طیور سرکوب شده در مقایسه با طیور طبیعی، وزن بورس فابریسیوس و عیار آنتی بادی HI به میزان قابل توجهی کاهش نشان داد. در این طیور همچنین کاهش قابل توجهی در میزان ترشح آ نتی بادی IgA در ترشحات نای و دئودنوم روده و صفرا در مقایسه با طیور طبیعی، در طول آزمایش مشاهده گردید. درطیور سرکوب شده درآزمایش ایمینو هیستو شیمیائی تعداد کمی سلول های IgA مثبت در بافت روده بیست و هشت روز پس از واکسیناسیون دیده شد و این طیور در چالش با ویروس حاد اثر محا فظتی کمی نشان دادند. این نتایج سبب افزایش دانش ما در زمینه اثر پاسخ ایمنی مخاطی طیور در برابر واکسن بیماری نیوکاسل است.
واژه های کلیدی : واکسن نیوکاسل، سیکلوفسفامید، سرکوب ایمنی، ایمنی مخاطی، IgA
مقدمه
سرکوب ایمنی، وضعیت غیر طبیعی ایمنی است که سبب کاهش پاسخ ایمنی در برابر آنتی ژن ها و افزایش حساسیت در برابر یبماری است. گله های طیور که بوسیله عواملی مانند استرس و عفونت، ایمینو ساپروسیو شده اند دجار پدیده بیولوژیکی متداول در این صنعت شده و باعث خسارات سنگین اقتصادی میگردند. ایمینوساپروسیو دارای اثر معکوس در گله است که غالبا" سبب عفونت ثانویه ، عفونت های کمپلکس و یا کاهش اثر ایمنی گله های طیوریکه بشکل متداول واکسینه میگردند، میشود Sharma et al .,2000) )
سیستم ایمنی در طیور از پستانداران متفاوت است و بورس فابریسیوس تنها عضو مرکزی ایمنی طیور است که در تکامل طبیعی لمفوسیت های B دارای نقش اصلی است ( .(Weill and Reynaud,1987سلول های B وابسته در طیور، الگوی مناسبی جهت مطالعه تکامل ژنتیکی لمفوسیت های B میباشند. (Nowak et al .,1990 ). سیکلوفسفا مید عامل مهار ایمنی است که قادر به تخلیه لمفوسیت های B بوده وهمچنین تاثیر نسبی بر ایمنی سلولی دارد. بر اساس گزارشات، تزریق سیکلوفسفامید در طیور سبب تخریب انتخابی سلولهای B و منجر به مهار ایمنی هومورال میگردد.( Corrier et al 1991 ) بنابراین سیکلوفسفامید سبب اختلال ایمنی در طیور جوان شده و روش مناسبی برای مطالعه مکانیسم دفاع ایمنی هومورال میزبان پس از عفونت های میکروبی است ( Linna et al (1972 ;Markowski Grimsrud and Schat,2003)
بیماری نیوکاسل یکی از مهمترین بیماری های طیور در سراسر دنیا است Al- Garib et al ;2003) ) ایمنی زائی بر اثر واکسیناسیون فاکتور اصلی جهت پیشگیری از این بیماری است و اثر مناسبی دارد Van Boven et al ,2008) ) ولی هنوز هم ناتوانی ایمنی در طیور مشکل اساسی در پیشگیری از این بیماری است. بطور کلی ایمنی هومورال، ایمنی اصلی در بیماری ویروسی نیوکاسل است. ایمنی در بیماری نیوکاسل با تعیین عیار آنتی بادی سرم با آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون (HI ) و عیار بالا به عنوان کلیدی مطمن در ایمنی گله مورد پذیرش میباشد .Beard and Hanson.2003) ). پس از چالش با سویه حاد ویروس نیوکاسل گله های طیور با میزان آنتی بادی بالای سرمی و یا میزان عیار سرمی بسیار کم، مورد حفاظت قرار نگرفتند، و رخداد بیماری مشهود است. ( (Awan et al .,1994
در ازمون چالش، شواهدی مبنی بر وجود عبار آنتی بادی سرمی HI که در ارتباط مستقیم با میزان مقاومت طیور با بیماری است ،وجود ندارد (Jayawardane and Spradbrow.,1995 Reynolds and Maraqa,2000:Erf,2004) گرچه پاسخ ایمنی سلولی ممکن است سه روز پس از واکسیناسیون با واکسن تخفیف حدت یافته نیو کاسل دیده شود ولی بتنهائی جهت محافظت بر علیه ویروس حاد نیو کاسل کافی نیست Reynolds and Maraqa,2000) ) .ثابت شده است ، ایمنی مخاطی با ترشح و تولید ,IgA نقش موثری را در روند تکامل مقاومت طیور واکسینه شده بر علیه بیماری دارد. (Takada and Kida ,1996; Reynolds and Maraqa ,2000;Scott,2004) ) . لازم بذکر است که بورس فابریسیوس عضو لمفوئیدی مرکزی جهت ساختن سلولهای لمفاوی B و لمفوسیت ها ی بالغ است که محیط میکرو لازم را برای رشد سریع سلولهای B که دچار تغییرات ژنتیکی لازم حهت تولید آنتی بادی های موثر بر علیه آنتی ژنهای خارجی است فراهم میکند Tizard ,2002;) Ratcliffe ,2006 . )گزارشات کمی در مورد اثر آسیب یا اکیلیوزیز بورس فابریسیوس در پاسخ ایمنی مخاطی در طیور واکسینه شده به وسیله واکسن زنده نیوکاسل وجود دارد. هدف از این بررسی تهیه مدل سرکوب ایمنی در طیور (Specific Pathogen free) SPF بوسیله سیکلوفسفامید است. اثر مهار ایمنی در پاسخ مخاطی طیور SPF واکسینه شده با واکسن زنده نیوکاسل تعیین گردید. و نتایج نشان داد که پاسخ ایمنی مخاطی نقش مهمی در مقاومت طیور در برابر چالش با ویروس حاد نیوکاسل دارد.
مواد و روش کار
واکسن و ویروس
سویه ویروسی لاسوتا در واکسن زنده نیوکاسل تهیه و پس از تهیه رقت مناسب در جوجه های سه هفته، به شکل تجربی تزریق شد لازم بذکر است که هر یک دز واکسن شامل 106= (%50 Embryonated Infectious Dose) EID50 /ml ذرات عفونی از ویروس نیوکاسل است. در چالش، از سویه حاد نیوکاسل با عیار و دز عفونی برابر با 107EID 50/ ml = استفاده گردید.
مهار ایمنی طیور
به منظور ایجاد سرکوب ایمنی، بیست وچهار ساعت پس از تفریخ (جوجه در آوری)، طیور (Specific Pathogen free) SPF بو سیله سیکلوفسفامید (شرکت سیگما) به میزان سه میلی گرم/ کیلوگرم وزن، به مدت چهار روز بصورت داخل عضلانی تزریق شد.Lam and Hao, 1987)) . سرکوب ایمنی بوسیله اوزان نسبی اعضای ایمنی شامل بورس فابریسیوس، تیموس و طحال و سنجش عیار آنتی بادی سرمی در طیور مورد آزمایش، تعیین گردید.
طراحی آزمایش و جمع آوری نمونه
در این مطالعه تعداد 150 طیور در سن یک روزه گی به سه گروه 50 تائی تقسیم شدند گروه اول تحت تاثیر سیکلوفسفامید قرار نگرفتند و واکسینه هم نشدند و به عنوان گروه کنترل منفی در نظرگرفته شدند.. گروه دوم واکسینه شدند و تحت تاثیر سیکلوفسفامید قرار نگرفتند و گروه سوم هم تحت تاثیر سیکلوفسفامیدگرفتند و واکسینه شدند. بعبارت دیگر ، هر یک از طیور گروه دوم و سوم در سن سه هفتگی با یک دز از سویه لاسوتا ویروس زنده نیوکاسل به روش قطره چشمی - بینی واکسینه شدند. در شروع سه قطعه از هر گروه در سنین یک الی پنج هفتگی سر بریده و کشته شدند و اعضای بورس فابریسیوس، غدد تیموس و طحال توزین شدند و وزن نسبی هر عضو به نسبت بخشی از وزن لاشه محاسبه گردید. سپس سه قطعه از هر گروه در 3 روزه گی و یک الی شش هفتگی پس از واکسیناسیون سر بریده شدند از قلب هر جوجه به میزان سه میلی لیترخون گرفته شد و سپس سرم بوسیله سانتریفیوژکردن جداسازی، و در 20 - درجه سانتی گراد نگهداری گردید. محتویات نای بوسیله وارد کردن سوزن از انتهای نای برداشت شد و در 5 میلی لیتر بافر نمکی فسفات سرد محتوی 1% آلبومین سرم گاوی قرار داده شد و چندین مرتبه شستشو، و جمع آوری شد. محتویات دئودنوم روده از 5 سانتی متری روده بوسیله شکاف دادن از روده گرفته شد و در بافر فسفات سرد نمکی محتوی 1% سرم گاو و1/0درصد تریپسین قرار داده شد. و همچنین صفرا از کیسه صفرا با استفاده از سوزن شماره22 جمع آوری شد و تمام نمونه ها در 20 - درجه سانتی گراد قبل از انجام آزمون الیزا نگهداری شدند . نمونه ها ی روده (دئودنوم، ژوژونوم و ایلئوم ) در پارا فرم آلدئید 4% ثابت شدند.
تعیین ایمنی هومورال در بیماری نیوکاسل
ایمنی هومورال بوسیله آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون ارزیابی شد ( Rauw et al ., 2009) در این آزمون از چهار واحد آگلوتیناسیون سویه ویروسی لاسوتای نیوکاسل استفاده شد و میزان آنتی بادیHI با تهیه رقت های دو برابر از سرم تعیین شد . عیار آنتی بادی یه صورت معیار لگاریتمی در بالاترین رقتی که از آگلوتیناسیون کامل ممانعت می کرد نشان داده میشود .
تعیین ایمنی مخاطی در بیماری نیوکاسل
در بیماری نیو کاسل ایمنی مخاطی به وسیله آزمون الیزا با میزان آنتی بادی IgA تعیین گردید. ( Rauw et al ., 2009.) . عیارسنجی جهت تعیین رقت دلخواه همه معرف ها بدین شرح انجام شد:
در یک پلیت شامل 96 حفره ای، میزان 7 /15 میکرو گرم در میلی لیتر از ویروس غیر فعال نیوکاسل رقیق شده در بافر 5 0/0 مول بیکربنات باPH مساوی 6/9 در دمای 0C4 سانتی گراد، آزمون الیزا انجام گردید . روز بعد پلیت ها سه مرتبه بوسیله بافر فسفات نمکی محتوی 5 0/0 درصد توین 20 ( (PBSTشستشوداده شد و بوسیله بافر PBST محتوی َBSA یک در صد، مدت یک ساعت در 37 درجه متوقف گردید. مایعات نای ، دئودنوم روده و صفرا از طیور مورد آزمایش در بافر 1 درصد BSA / PBST رقیق شد و به پلیت اضافه شد و مدت یک ساعت در گرمخانه با دمای 37 درچه نگهداری شد. پس از پنج بار شستشو آنزیم کونژوگه رقیق شده در بافر یک در صد BSA / PBST به میزان 1 در ده هزار به پلیت اضافه شد و مدت یک ساعت در دمای گرمخانه 37 درجه گذاشته شد و پس از شش بار شستن پلیت ها محلول سوبسترای تترا متیل بنزیلات (TMB ) اضافه شد و مدت پانزده دقیقه در 37 درجه مکث و سپس محلول متوقف کننده اسید سولفوریک دو مول اضافه شد و میزان دانسیته اپتیکال (OD) هر یک از چاهک های پلیت را در طول موج450 نانومتر بوسیله دستگاه قرائت کننده خوانده و محاسبه گردید.
شناسائی ایمینو هیستو شیمیائی سلول های روده ای IgA مثبت
نمونه هائی از قسمت های مختلف روده ( دئودنوم ژوژونوم وا ئلئوم ) را در پارا فرم آلدئید4% فیکس نموده و نمونه های پارافین شده را بر اساس روش متداول تهیه نموده و قطعات پارافینی سری به ضخامت 5 میکرمتر بریده و به وسیله استرپتاودین - بیوتین پراکسیداز (SP ) رنگ آمیزی شد . Oliveira et al ., 2006)) و پس از خارج ساختن اسلاید ها از پارافین ،آنتی ژنها با کمک امواج میکرو در بافر اسید سیتریک به مدت بیست دقیقه قبل از رنگ آمیزی محددا"بدست آورده شد. و با قرار گرفتن در گرمخانه در 3 /0 درصد پراکسید هیدروژن در الکل متیلیک برای سی دقیقه گذاشته سپس با شستشو در بافر نمکی فسفات بمدت پنج دقیقه فعالیت آنزیمی پر اکسید را متوقف نموده و با قرار دادن قطعات در سرم بزی نرمال 5% و بافر فسفات نمکی به مدت سی دقیقه باند های غیراختصاصی به حداقل تقلیل یافتند قطعات در یک جعبه مرطوب در 4 درجه به مدت یک شبانه روز با آنتی بادیIgG تهیه شده نگهداری شدند. برای کنترل منفی هم از BSA یک در صد بجای آنتی بادی اولیه استفاده شد. پس از شستشو، اسلاید ها بمدت سی دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند همراه با آنتی بادی نشاندار شده با بیوتین و پس از شستن، اسلاید ها را برای مدت ده دقیقه در دمای اتاق با کمپلکس آویدین- بیوتین پراکسیداز قرار داده با استفاده از محلول دی آمینو بنزدین هماتوکسیلین تازه قطعات رنگ آمیزی شده برای مدت ده دقیقه در آن قرار داده شد.
آزمون چالش
طیور هر گروه را بیست وهشت روز پس از واکسیناسیون در مکان قرنطینه شده با سویه حاد ویروس نیوکاسل که عیاری (تیتری ) معادل 104 از 50% دز عفونی جنینی (EID50) داشت به هر جوجه به میزان 2 /ه میلی لیتر که در بافر فسفات نمکی رقیق شده بود روش چشمی - بینی تزریق شد.. پس از چالش علائم بالینی بیماری و مرگ و میر، روزانه برای مدت چهارده روز ثبت شد. طیوری که علائم تیپیک بالینی بیماری نیوکاسل را نشان دادند و یا مردند را به عنوان طیورغیر ایمن در نظر گرفته شدند .
آنالیزآماری
اطلاعات با استفاده از برنامه نرم افزاری SPSS18.0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و نتایج بشکل میانگین انحراف استاندارد SD ) ± Mean ) بیان شد. مقایسه میانگین های بدست آمده با استفاده از آزمون های uncan ,s multiple range بدست آمد میزان واریانسo.o5 P< به عنوان شاخص آماری مهم در نظر گرفته شد.
نتایج
اثر سیکلوفسفامید بر اوزان نسبی بورس فابریسیوس ، غده تیموس و طحال نسبت به وزن بدن طیور
نسبت اوزان بورس فابریسیوس، تیموس و طحال به وزن بدن طیور در روز های متفاوت پس از تحت تاثیر قراردادن سیکلوفسفامید از روز های هفتم تا سی وپنچ روزه گی محاسبه شد (جدول -1) . تفاوت چشمگیری بین اوزان نسبی اعضا ی ایمنی گروه کنترلی و گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند وجود نداشت o.o5) P> ) اما اوزان نسبی بورس فابریسیوس گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند در مقایسه با گروه کنترلی و گروهی که تحت تاثیر سیکلو فسفامید نبودند بشکل قابل توجهی کاهش داشت o.o5) P < ) و اوزان نسبی تیموس و طحال گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند از گرو هی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند از روز 7- 21 روزه گی بشکل قابل توجهی کمتربود. o.o5) P< ) . اختلافات از 35-28 روزه گی قابل توجه نبود . o.o5) P> ).
پاسخ آنتی بادی HI سرمی به ویروس نیوکاسل
درآزمون HI ، در گروه کنترل پاسخ به ویروس نیوکاسل دیده نشد. لیکن عیار آنتی بادی HI درگروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند ، در برابر واکسن زنده نیوکاسل بتدریج از روز هفتم پس از واکسینه شدن افرایش داشت و در روز 21 به حداکثر خود رسید. در طول آزمایش، عیار آنتی بادی سرمی HI در جوجه های تحت آزمایش پس از واکسینه شدن با گروهی که تحت تاثیر سیکلو فسفامید بودند بشکل قابل توجهی کمتر از گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند، شد. (P<0.01 )
پاسخ آنتی بادی IgAدر شستشوی محتویات نای و دئودنوم و صفرا
میزان آنتی بادی IgA در بیماری نیوکاسل در محتویات شستشوی شده نای و دئودنوم و صفرا در طیور تحت آزمایش پس از واکسینه شدن با واکسن زنده نیوکاسل در آزمون الیزا مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان آنتی بادی IgG در محتویات شسته شده نای در طیور واکسینه شده که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند سه روز پس از واکسینه شدن افزایش یافت و 28روز پس از واکسیناسیون به حداکثر میزان خود رسید.میزان آنتی بادی IgA هم در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند در تمام دوره آزمایش از نظر آماری کمتر از گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودندبود( P<0.01 ) از ر وز 3 الی 14 روز پس از واکسیناسیون میزان آنتی بادی IgA در محتویات شسته شده نای در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بسیار کم بود ولی بتدریج افزایش نشان داد و در روز 28 به حد ا کثر رسید که مشحصا" بیشتر از گروه کنترلی بود. P<0.05) ) پاسخ های واکسن نیوکاسل در محتویات شسته شده دئودنوم و صفرا هم مانند محتویات شسته شده نای بود.
سلول های IgA مثبت روده ای در( دئودنوم ژوژونوم و ایلئوم )
سلول های IgA مثبت روده ای بوسیله روش ایمینو هیستو شیمیائی مورد شناسائی قرار گرفتند و نتایج نشان داد که سلول های IgA مثبت اکثرا" در لایه لامینا تحت مخاطی و مرکز پرز های قسمت های مختلف روده مانند دئودنوم ژوژنوم و ایلوم قرار دارند. در دئودنوم و ژوژونوم و ایلئوم طیوری که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند در مقایسه با طیور تحت تاثیر، 28 روز پس از واکسیناسیون ، تعداد سلول هایIgA مثبت بیشتری مشاهده گردید.
ارتباط بین نتایج سرولوژیکی قبل از چالش و میزان مرگ ومیر پس از چالش
همانگونه که در جدول 2 نشان داده شده است طیور درگروه کنترل پس از چالش با ویروس حاد نیو کاسل، نشانی های بیماری را روز سوم نشان دادند و همه آنها تا روز ششم ، قبل از جالش مردند . میزان آنتی بادی IgA در نای و محتویات شسته شده دئودنوم گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند بشکل قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود ( 05/0 P<) و میزان عیار آنی بادی HI سرمی 26 بود. بدین ترتیب بیست طیور پس از چالش زنده ماندند و میزان ایمنی محافظت کننده 100% بود . درگروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید قرار داشتند قبل از چالش عیار آنتی بادی، HI سرمی 1 2 بودکه در مقایسه باگروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند بشکل قابل توجهی کمتر بود ( 05/0 P<). حال آنکه میزان آنتی بادی IgA در نای و دئودنوم بصورت قابل توجهی بیش از گروه کنترل بود ( 05/0 P<). وتعداد دوازده طیور در این گروه پس از چالش زنده ماندند و میزان ایمنی محافظت کننده آنها 60% بود. نتایج نشان داد که آنتی بادی IgA در سیستم تنفسی و گوارشی نقش مهمی را در مقاومت طیور در برابر چالش با ویروس حاد نیوکاسل ایفا می کند.
بحث
بورس فابریسیوس، تیموس و طحال از اعضای مهم ایمنی طیور میباشند. در تیموس و بورس فابریسیوس لمفوسیت های B , T از یکدیگر متمایز شده، رشد یافته و بالغ میشوند . طحال از اعضای مهمی است که در پاسخ ایمنی نقش داردNiu ,2004) ) بنابراین سطح ایمنی ارتباط نزدیکی با رشد و عمل این اعضای داردLiu , et al .,2006) ) اندیس در طیور نشان دهنده وضعییت رشد اعضای ایمنی است که از نسبت وزن اعضای ایمنی به وزن بدن حاصل می گرددDong et al .,2007) ). سیکلوفسفامید از مهار کننده های ایمنی رایجی است که از خونسازی در مغز استخوان ممانعت میکند و مانع سنتز لمفوسیت های B ,T شده و بویژه نسبت به لمفوسیت های B حساس است و عموما " اثرات سیکلوفسفامید در طیور بصورت بورسکتومی است (Elmubarak et al ., 1981 ) این ماده میتواند مانع رشد بورس فابریسیوس ، تکثیر لمفوسیت های B و کاهش ایمنی هوموال باشد . ) Hemendinger , Bloom ,1996 ).
ْGlick در سال 1986 گزارش کرد که تزریق سیکلوفسفامید در ابتدا سبب مهار لمفوسیت های وابسته به بورس شده و مانع ایمنی هومورال میشود و در طیور جوان ، تزریق سیکلوفسفامید می تواند سبب حذف پاسخ ایمنی هومورال در برابر بیماری های عفونی ویروسی بورس فابریسیوس ( IBDV) شده و همجنین موجب مهار پاسخ لمفوسیت ها و کاهش بارز مقدار لمفوسیت های خون محیطی میشود (Yeh et al .,2002 ). نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد وزن نسبی بورس فابریسیوس در طیوریکه تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند در مقایسه باگروهی که تحت تاثیر نبودند در طول 35 روز پس از درمان، کمتر بود( 01/0 P<) . اوزان نسبی تیموس و طحال گروه تحت تاثیر سیکلوفسفامید از گروهی که فاقد آن بودند در سن هفت الی بیست یک روزه گی کمتر بود ( 5 0/0 > P ) 1 نتایج جدول - 1گزارشات Corrier و همکاران در سال 1991 و Renolds و همکاران Maraqa در سال 1999 و Ei- Abasy و همکاران در سال 2004 مشا به است. در طیور با سرکوب ایمنی، مهار شدید ایمنی هومرال و کاهش قابل توجه عیار HI پس از واکسینه کردن با واکسن نیوکاسل مشاهده می گردد که این یافته ها در تائید گزارشات (Eskola and Toivane ,1974 : Lam and Hao,1987) است. پس از واکسینه کردن در روز بیست ویکم عیار آنتی بادی HI در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بسیار کمتر از گروهی بود که تحت تاثیر آن نبودند ( 1 0/0 P < ). نتایج حاصل نشان داد که سرکوب ایمنی بوسیله سیکلوفسغامید موفیقیت آمیز است بعبارت دیگر ایمنی هومورال بوسیله سیکلوفسفامید مهار شده و سلولهای بنیادی لمفوسیتی B قادر به تمایز و بالغ شدن در بورس فابریسیوس نیستند ( زیرا بورس فابریسیوس بشکل طبیعی قادر به رشد نیست و بشدت آتروفی یافته) و به سمت بافتهای لمفاوی محیطی مهاجرت میکنند و تعداد این لنفوسیت ها در بورس بصورت قابل توجهی کاهش مییابند. . در این بررسی میزان آنتی بادی IgA در محتویات شسته شده نای، دئودنوم و صفرا در گروه با سیکلوفسفامید بشدت کاهش یافت ( 5 0/0 P < ) علاوه بر آن نتایج حاصل از ایمینو هیستو شیمیائی نشان داد که سلولهای IgA مثبت در روز بیست و هشتم پس از واکسینه شدن در مخاط روده در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بشدت کمتر از گروهی که تحت تاثیر آن نبودند شد . این نتایج بیانگر آنست که سلولهای اجدادی IgA مثبت در بافتهای لمفوئیدی محیطی ممکن است از سلولهای وابسته به بورس باشند و غالبا از سلولهای بنیادی لمفوئیدی منشا ء گرفته و در مراحل نخست در بورس تمایز یافته و بالغ شده اند ، چنانچه بورس فابریسیوس دجار مهار ایمنی شود پاسخ ایمنی مخاطی هم دچار مهار و توقف خواهد شد. ایمنی هومورال سیستمتیک و ایمنی مخاطی بایکدیگر ارتباط دارند و مستقل ازیکدیگر نیستند( ذکر رفرانس ). مهار ایمنی بوسیله سیکلوفسفامید با دوام نبوده و در مرحله پایانی آزمایش گرچه بورس فابریسیوس طیور آسیب دیده و خونسازی مغز استخوان ممکن است ترمیم یابد و .بدین طریق لمفوسیت های جدید B که از مغز استخوان منشاء گرفته اند قادر به حرکت بوده و بسمت اندام های لمفوئیدی محیطی و بافتهای لمفوئیدی مخاطی میروند علاوه بر آن مراکز زایگر مخاطی لمفوسیت های B ممکن است تدریجا" در این مناطق تشکیل گردند. بنابراین ممکن است اثر مهارکنندگی سیکلوفسفامید در پاسخ ایمنی در مخاط در طول مرحله پایانی تکامل یابد. .میزان IgA در محتویات شسته شده نای دئودنوم و صفرا در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بصورت قابل توجهی از روز 14 پس از واکسینه کردن افزایش داشته و میزان مشخصی از سلولهای IgA مثبت در مخاط روده ای گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند 28 روز پس از واکسینه کردن یافت شد علاوه بر آن 60% طیور یکه تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند پس از چالش با ویروس حاد نیو کاسل زنده ماندند . مطالعات قبلی ثابت کرد که سیکلوفسفامید در طیوری که تازه از تخم خارج شده اند تاثیر کمی بر روی تیموس دارد و توانائی تولید ایمنی زائی سلولی را هم دارد ( Linna et al., 1972 : Kowalski et al .,1978 ( بنابراین ایمنی سلولی در طیور تحت تاثیر سیکلوفسفامید در روز 28 پس از واکسینه کردن بیشتر ترمیم یافته و بشکل قابل توجهی از پرندگان غیر متاثر متفاوت نمیباشد . نتایج بالا ببصورت کامل ثابت کرد که پاسخ ایمنی مخاطی نقش مهمی را بر علیه عفونت نیوکاسل بازی میکند." این بررسی نشان داد که اولا* پاسخ ایمنی مخاطی در طیوری که تازه از تخم خارج شده ا ند و با واکسن زنده نیوکاسل واکسینه شده اند تحت تاثیر سیکلوفسفامید بشدت آسیب دیده و در ضمن قسمتی از اثرسرکوب ایمنی مخاطی به وسیله سیکلوفسفامید از روز 21 پس از واکسینه شدن ب ترمیم یافته و علاوه بر آن نقش ایمنی مخاطی در مقاومت به ویروس حاد نیوکاسل بوسیله آزمون چالش هم مشخص شد. و این یافته ها درک بهتری از پاسخ ایمنی مخاطی را در برابر واکسن نیوکاسل ارائه میکند و پیشنهاد میدهد که ایمنی مخاطی نقش ارزندهای بر علیه عفونت بیماری ویروسی نیوکاسل دارد.
References
Al-Garib SO, ALJ Gielkens, E Gruys and G Kochi, 2003.Review of Newcastle disease virus with particular references to immunity and vaccination. World’s
Poult Sci J, 59: 185-200.
Awan MA, MJ Otte and AD James, 1994. The epidemiology of Newcastle disease in rural poultry: a review. Avian Pathol, 23: 405-423
Beard CW and RP Hanson, 2003. Newcastle disease.Pages 452-470 in Diseases of Poultry. MS Hofstad,
JH Barnes, BW Calnek, WM Reid, HW Yoder, eds.Iowa State University Press, Ames, IA.Corrier DE, MH Elissalde, RL Ziprin and JR DeLoach,
1991. Effect of immunosuppression with cyclophosphamide, cyclosporin, odexamrthasone on salmonella colonization of broiler chicks. Avain Dis, 35: 40-45.
Dong XF, SK Wang, RN Sa, Q Zhang and JM Tong, 2007. Effect of immunosuppressant cyclophosphamide on performance and incretion in broiler.
Acta Vet Zootechnica Sinica, 38: 993-998.
Ei-Abasy M, M Motobu, K Nakamura, K Koge, T Onodera, O Vainio, P Toivanen and Y Hirota, 2004.Preventive and therapeutic effects of sugar cane
extract on cyclophosphamide induced immunosuppression in chickens. Int
Immunopharmacol, 4:983-990.
Elmubarak AK, JM Sharma, LF Lee and VL Sanger, 1981. Suppression of immunologic function and degeneration of lymphoid organs in cyclophosphamide-treated turkeys. Am J Vet Res, 42: 2122-2128.
Erf G F, 2004. Cell-mediated immunity in poultry. Poult Sci, 83: 580-590.
Eskola J and P Toivane, 1974. Effect of in ovo treatment with cyclophosphamide on lymphoid system in chicken. Cellular Immunol, 13: 459-471
Fabienne Rauw, Yannick Gardin, Vilmos Palya, Steven Van Borm, Martine Gonze, Sophie Lemaire, Thierry Van 2009) Humoral, cell-mediated and mucosal immunity induced by oculo-nasal vaccination of one-day-old SPF and conventional layer chicks with two different live Newcastle disease vaccines Vaccine Volume: 27, Issue: 27, Pages: 3631-3642
Glick B, 1986. Avian immune capacity and bone marrow cellularity after in ovo treatment with cyclophosphamide. Int Arch Allergy Appl Immunol, 79: 95-100.
Hemendinger RA and SE Bloom, 1996. Selective mitomycin C & cyclophosphamide induction of apoptosis in differentiating B lymphocytes compared to T lymphocytes in vivo. Immunopharmacol, 35: 71-82.
Jayawardane GWL and PB Spradbrow, 1995. Mucosal immunity in chickens vaccinated with the V4 strain of Newcastle disease virus. Vet Microbiol 46: 69-77.
Kowalski WJ, M Malkinson, GA Leslie and PA Small, 1978. The secretory immunological system of the fowl: VI. The effect of chemical bursectomy on
immunoglobulin concentration in tears. Immunol, 34: 663-667.
Lam KM and Q Hao, 1987. Vaccination of cyclophosphamide-treated chickens against Newcastle disease virus infection. Vet Microbiol, 15: 41-48.
Lambrecht B, M Gonze, G Meulemans and T Van Den Berg, 2004. Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken interferon-gamma in response to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimulation. Avian Pathol, 33: 343-350.
Linna TJ, D Frommel and RA Good, 1972. Effects of early cyclophosphamide treatment on the development of lymphoid organs and immunological functions in the chicken. Int Arch Allergy appl Immunol, 42: 20.
Liu YF, JS Ma, YJ Huang, XL Huang and JC Liao, 2006. Effects of glutamine on development of immuneorgans and immune functions in broilers. Chin J Vet
Sci, 26: 567-569.
Markowski-Grimsrud CJ and KA Schat, 2003. Infection with chicken anaemia virus impairs the generation of pathogen-specific cytotoxic T lymphocytes.
Immunol, 109: 283-294.
Niu ZX, 2004. The immune system. In: VeterinaryImmunology (Cui ZZ, Cui BA ， eds). China Agriculture Press，Beijing, China, pp: 13-18.
Nowak JS, O Vainio and O Lassila, 1990. In vitro organ culture of embryonic bursa of Fabricius. Dev Comp Immunol, 14: 239-246.
Oliveira CA, LF Telles, AG Oliveira, E Kalapothakis, H Gonçalves - Dornelas and GA Mahecha, 2006. Expression of different classes of immunoglobulin in intraepithelial plasma cells of the Harderian gland of domestic ducks Anas platyrhynchos. Vet Immunol Immunopathol,113: 257-266.
Ratcliffe MJH, 2006. Antibodies, immunoglobulin genes and the bursa of Fabricius in chicken B cell development. Dev Comp Immunol, 30: 101-118.
Rauw F, Y Gardin, V Palya, S Van Borm, M Gonze, S ,Lemaire, T Van Den Berg and B Lambrecht, 2009. Humoral, cell mediated and mucosal immunity induced by oculo-nasal vaccination of one day-old SPF and conventional layer chicks with two different live Newcastle Disease vaccines. Vaccine, 27: 3631-3642.
Reynolds DL and AD Maraqa, 1999. A technique for inducing B-cell ablation in chickens by in ovo injection of cyclophosphamide. Avian Dis, 43: 367-375.
Reynolds DL and AD Maraqa, 2000. Protective immunity against Newcastle Disease: the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides.Avian Dis, 44: 138-44.
Scott TR, 2004. Our current understanding of humoral immunity of poultry. Poult Sci, 83: 574-579.
Sharma JM, IJ Kim, S Rautenschlein and HY Yeh, 2000.Infectious bursa disease virus of chickens:pathogenesis and immunosuppression. Dev Comp Immunol, 24: 223-235.
Takada A and H Kida, 1996. Protective immune response of chickens against Newcastle disease, induced by the intranasal vaccination with inactivated virus. Vet Microbiol, 50: 17-25.
Tizard I, 2002. The avian antibody resp Exot onse. Semin Avianic Pet Med, 11: 2-14.
Van Boven M, A Bouma, THF Fabri, E Katsma, L Hartog and G Koch, 2008. Herd immunity to Newcastle. disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol,
37: 1-5.
Weill, JC and C A Reynaud, 1987. The chicken B cell compartment. Science, 238:1094-1098.
Yeh HY, S Rautenschlein and JM Sharma, 2002.Protective immunity against infectious bursal disease virus in chickens in the absence of virus-specific antibodies. Vet Immunol Immunopathol, 89: 149-158.
ایمنی مخاطی نقش مهمی در برابر عفونت نیوکاسل دارد. در طیور طبیعی و سرکوب شده ، که با سویه زنده لاسوتای ویروس نیوکاسل به روش قطره چشمی _ بینی در سن سه هفتگی، واکسینه شدند پس از بیست وهشت روز از زمان واکسیناسیون با سویه حاد ویروس نیوکاسل مورد چالش قرار گرفتند و ایمنی مخاطی در آنها بررسی گردید. مهار ایمنی در طیور بوسیله سیکلو فسفامید انجام گرفت. در طیور سرکوب شده در مقایسه با طیور طبیعی، وزن بورس فابریسیوس و عیار آنتی بادی HI به میزان قابل توجهی کاهش نشان داد. در این طیور همچنین کاهش قابل توجهی در میزان ترشح آ نتی بادی IgA در ترشحات نای و دئودنوم روده و صفرا در مقایسه با طیور طبیعی، در طول آزمایش مشاهده گردید. درطیور سرکوب شده درآزمایش ایمینو هیستو شیمیائی تعداد کمی سلول های IgA مثبت در بافت روده بیست و هشت روز پس از واکسیناسیون دیده شد و این طیور در چالش با ویروس حاد اثر محا فظتی کمی نشان دادند. این نتایج سبب افزایش دانش ما در زمینه اثر پاسخ ایمنی مخاطی طیور در برابر واکسن بیماری نیوکاسل است.
واژه های کلیدی : واکسن نیوکاسل، سیکلوفسفامید، سرکوب ایمنی، ایمنی مخاطی، IgA
مقدمه
سرکوب ایمنی، وضعیت غیر طبیعی ایمنی است که سبب کاهش پاسخ ایمنی در برابر آنتی ژن ها و افزایش حساسیت در برابر یبماری است. گله های طیور که بوسیله عواملی مانند استرس و عفونت، ایمینو ساپروسیو شده اند دجار پدیده بیولوژیکی متداول در این صنعت شده و باعث خسارات سنگین اقتصادی میگردند. ایمینوساپروسیو دارای اثر معکوس در گله است که غالبا" سبب عفونت ثانویه ، عفونت های کمپلکس و یا کاهش اثر ایمنی گله های طیوریکه بشکل متداول واکسینه میگردند، میشود Sharma et al .,2000) )
سیستم ایمنی در طیور از پستانداران متفاوت است و بورس فابریسیوس تنها عضو مرکزی ایمنی طیور است که در تکامل طبیعی لمفوسیت های B دارای نقش اصلی است ( .(Weill and Reynaud,1987سلول های B وابسته در طیور، الگوی مناسبی جهت مطالعه تکامل ژنتیکی لمفوسیت های B میباشند. (Nowak et al .,1990 ). سیکلوفسفا مید عامل مهار ایمنی است که قادر به تخلیه لمفوسیت های B بوده وهمچنین تاثیر نسبی بر ایمنی سلولی دارد. بر اساس گزارشات، تزریق سیکلوفسفامید در طیور سبب تخریب انتخابی سلولهای B و منجر به مهار ایمنی هومورال میگردد.( Corrier et al 1991 ) بنابراین سیکلوفسفامید سبب اختلال ایمنی در طیور جوان شده و روش مناسبی برای مطالعه مکانیسم دفاع ایمنی هومورال میزبان پس از عفونت های میکروبی است ( Linna et al (1972 ;Markowski Grimsrud and Schat,2003)
بیماری نیوکاسل یکی از مهمترین بیماری های طیور در سراسر دنیا است Al- Garib et al ;2003) ) ایمنی زائی بر اثر واکسیناسیون فاکتور اصلی جهت پیشگیری از این بیماری است و اثر مناسبی دارد Van Boven et al ,2008) ) ولی هنوز هم ناتوانی ایمنی در طیور مشکل اساسی در پیشگیری از این بیماری است. بطور کلی ایمنی هومورال، ایمنی اصلی در بیماری ویروسی نیوکاسل است. ایمنی در بیماری نیوکاسل با تعیین عیار آنتی بادی سرم با آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون (HI ) و عیار بالا به عنوان کلیدی مطمن در ایمنی گله مورد پذیرش میباشد .Beard and Hanson.2003) ). پس از چالش با سویه حاد ویروس نیوکاسل گله های طیور با میزان آنتی بادی بالای سرمی و یا میزان عیار سرمی بسیار کم، مورد حفاظت قرار نگرفتند، و رخداد بیماری مشهود است. ( (Awan et al .,1994
در ازمون چالش، شواهدی مبنی بر وجود عبار آنتی بادی سرمی HI که در ارتباط مستقیم با میزان مقاومت طیور با بیماری است ،وجود ندارد (Jayawardane and Spradbrow.,1995 Reynolds and Maraqa,2000:Erf,2004) گرچه پاسخ ایمنی سلولی ممکن است سه روز پس از واکسیناسیون با واکسن تخفیف حدت یافته نیو کاسل دیده شود ولی بتنهائی جهت محافظت بر علیه ویروس حاد نیو کاسل کافی نیست Reynolds and Maraqa,2000) ) .ثابت شده است ، ایمنی مخاطی با ترشح و تولید ,IgA نقش موثری را در روند تکامل مقاومت طیور واکسینه شده بر علیه بیماری دارد. (Takada and Kida ,1996; Reynolds and Maraqa ,2000;Scott,2004) ) . لازم بذکر است که بورس فابریسیوس عضو لمفوئیدی مرکزی جهت ساختن سلولهای لمفاوی B و لمفوسیت ها ی بالغ است که محیط میکرو لازم را برای رشد سریع سلولهای B که دچار تغییرات ژنتیکی لازم حهت تولید آنتی بادی های موثر بر علیه آنتی ژنهای خارجی است فراهم میکند Tizard ,2002;) Ratcliffe ,2006 . )گزارشات کمی در مورد اثر آسیب یا اکیلیوزیز بورس فابریسیوس در پاسخ ایمنی مخاطی در طیور واکسینه شده به وسیله واکسن زنده نیوکاسل وجود دارد. هدف از این بررسی تهیه مدل سرکوب ایمنی در طیور (Specific Pathogen free) SPF بوسیله سیکلوفسفامید است. اثر مهار ایمنی در پاسخ مخاطی طیور SPF واکسینه شده با واکسن زنده نیوکاسل تعیین گردید. و نتایج نشان داد که پاسخ ایمنی مخاطی نقش مهمی در مقاومت طیور در برابر چالش با ویروس حاد نیوکاسل دارد.
مواد و روش کار
واکسن و ویروس
سویه ویروسی لاسوتا در واکسن زنده نیوکاسل تهیه و پس از تهیه رقت مناسب در جوجه های سه هفته، به شکل تجربی تزریق شد لازم بذکر است که هر یک دز واکسن شامل 106= (%50 Embryonated Infectious Dose) EID50 /ml ذرات عفونی از ویروس نیوکاسل است. در چالش، از سویه حاد نیوکاسل با عیار و دز عفونی برابر با 107EID 50/ ml = استفاده گردید.
مهار ایمنی طیور
به منظور ایجاد سرکوب ایمنی، بیست وچهار ساعت پس از تفریخ (جوجه در آوری)، طیور (Specific Pathogen free) SPF بو سیله سیکلوفسفامید (شرکت سیگما) به میزان سه میلی گرم/ کیلوگرم وزن، به مدت چهار روز بصورت داخل عضلانی تزریق شد.Lam and Hao, 1987)) . سرکوب ایمنی بوسیله اوزان نسبی اعضای ایمنی شامل بورس فابریسیوس، تیموس و طحال و سنجش عیار آنتی بادی سرمی در طیور مورد آزمایش، تعیین گردید.
طراحی آزمایش و جمع آوری نمونه
در این مطالعه تعداد 150 طیور در سن یک روزه گی به سه گروه 50 تائی تقسیم شدند گروه اول تحت تاثیر سیکلوفسفامید قرار نگرفتند و واکسینه هم نشدند و به عنوان گروه کنترل منفی در نظرگرفته شدند.. گروه دوم واکسینه شدند و تحت تاثیر سیکلوفسفامید قرار نگرفتند و گروه سوم هم تحت تاثیر سیکلوفسفامیدگرفتند و واکسینه شدند. بعبارت دیگر ، هر یک از طیور گروه دوم و سوم در سن سه هفتگی با یک دز از سویه لاسوتا ویروس زنده نیوکاسل به روش قطره چشمی - بینی واکسینه شدند. در شروع سه قطعه از هر گروه در سنین یک الی پنج هفتگی سر بریده و کشته شدند و اعضای بورس فابریسیوس، غدد تیموس و طحال توزین شدند و وزن نسبی هر عضو به نسبت بخشی از وزن لاشه محاسبه گردید. سپس سه قطعه از هر گروه در 3 روزه گی و یک الی شش هفتگی پس از واکسیناسیون سر بریده شدند از قلب هر جوجه به میزان سه میلی لیترخون گرفته شد و سپس سرم بوسیله سانتریفیوژکردن جداسازی، و در 20 - درجه سانتی گراد نگهداری گردید. محتویات نای بوسیله وارد کردن سوزن از انتهای نای برداشت شد و در 5 میلی لیتر بافر نمکی فسفات سرد محتوی 1% آلبومین سرم گاوی قرار داده شد و چندین مرتبه شستشو، و جمع آوری شد. محتویات دئودنوم روده از 5 سانتی متری روده بوسیله شکاف دادن از روده گرفته شد و در بافر فسفات سرد نمکی محتوی 1% سرم گاو و1/0درصد تریپسین قرار داده شد. و همچنین صفرا از کیسه صفرا با استفاده از سوزن شماره22 جمع آوری شد و تمام نمونه ها در 20 - درجه سانتی گراد قبل از انجام آزمون الیزا نگهداری شدند . نمونه ها ی روده (دئودنوم، ژوژونوم و ایلئوم ) در پارا فرم آلدئید 4% ثابت شدند.
تعیین ایمنی هومورال در بیماری نیوکاسل
ایمنی هومورال بوسیله آزمون ممانعت از آگلوتیناسیون ارزیابی شد ( Rauw et al ., 2009) در این آزمون از چهار واحد آگلوتیناسیون سویه ویروسی لاسوتای نیوکاسل استفاده شد و میزان آنتی بادیHI با تهیه رقت های دو برابر از سرم تعیین شد . عیار آنتی بادی یه صورت معیار لگاریتمی در بالاترین رقتی که از آگلوتیناسیون کامل ممانعت می کرد نشان داده میشود .
تعیین ایمنی مخاطی در بیماری نیوکاسل
در بیماری نیو کاسل ایمنی مخاطی به وسیله آزمون الیزا با میزان آنتی بادی IgA تعیین گردید. ( Rauw et al ., 2009.) . عیارسنجی جهت تعیین رقت دلخواه همه معرف ها بدین شرح انجام شد:
در یک پلیت شامل 96 حفره ای، میزان 7 /15 میکرو گرم در میلی لیتر از ویروس غیر فعال نیوکاسل رقیق شده در بافر 5 0/0 مول بیکربنات باPH مساوی 6/9 در دمای 0C4 سانتی گراد، آزمون الیزا انجام گردید . روز بعد پلیت ها سه مرتبه بوسیله بافر فسفات نمکی محتوی 5 0/0 درصد توین 20 ( (PBSTشستشوداده شد و بوسیله بافر PBST محتوی َBSA یک در صد، مدت یک ساعت در 37 درجه متوقف گردید. مایعات نای ، دئودنوم روده و صفرا از طیور مورد آزمایش در بافر 1 درصد BSA / PBST رقیق شد و به پلیت اضافه شد و مدت یک ساعت در گرمخانه با دمای 37 درچه نگهداری شد. پس از پنج بار شستشو آنزیم کونژوگه رقیق شده در بافر یک در صد BSA / PBST به میزان 1 در ده هزار به پلیت اضافه شد و مدت یک ساعت در دمای گرمخانه 37 درجه گذاشته شد و پس از شش بار شستن پلیت ها محلول سوبسترای تترا متیل بنزیلات (TMB ) اضافه شد و مدت پانزده دقیقه در 37 درجه مکث و سپس محلول متوقف کننده اسید سولفوریک دو مول اضافه شد و میزان دانسیته اپتیکال (OD) هر یک از چاهک های پلیت را در طول موج450 نانومتر بوسیله دستگاه قرائت کننده خوانده و محاسبه گردید.
شناسائی ایمینو هیستو شیمیائی سلول های روده ای IgA مثبت
نمونه هائی از قسمت های مختلف روده ( دئودنوم ژوژونوم وا ئلئوم ) را در پارا فرم آلدئید4% فیکس نموده و نمونه های پارافین شده را بر اساس روش متداول تهیه نموده و قطعات پارافینی سری به ضخامت 5 میکرمتر بریده و به وسیله استرپتاودین - بیوتین پراکسیداز (SP ) رنگ آمیزی شد . Oliveira et al ., 2006)) و پس از خارج ساختن اسلاید ها از پارافین ،آنتی ژنها با کمک امواج میکرو در بافر اسید سیتریک به مدت بیست دقیقه قبل از رنگ آمیزی محددا"بدست آورده شد. و با قرار گرفتن در گرمخانه در 3 /0 درصد پراکسید هیدروژن در الکل متیلیک برای سی دقیقه گذاشته سپس با شستشو در بافر نمکی فسفات بمدت پنج دقیقه فعالیت آنزیمی پر اکسید را متوقف نموده و با قرار دادن قطعات در سرم بزی نرمال 5% و بافر فسفات نمکی به مدت سی دقیقه باند های غیراختصاصی به حداقل تقلیل یافتند قطعات در یک جعبه مرطوب در 4 درجه به مدت یک شبانه روز با آنتی بادیIgG تهیه شده نگهداری شدند. برای کنترل منفی هم از BSA یک در صد بجای آنتی بادی اولیه استفاده شد. پس از شستشو، اسلاید ها بمدت سی دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند همراه با آنتی بادی نشاندار شده با بیوتین و پس از شستن، اسلاید ها را برای مدت ده دقیقه در دمای اتاق با کمپلکس آویدین- بیوتین پراکسیداز قرار داده با استفاده از محلول دی آمینو بنزدین هماتوکسیلین تازه قطعات رنگ آمیزی شده برای مدت ده دقیقه در آن قرار داده شد.
آزمون چالش
طیور هر گروه را بیست وهشت روز پس از واکسیناسیون در مکان قرنطینه شده با سویه حاد ویروس نیوکاسل که عیاری (تیتری ) معادل 104 از 50% دز عفونی جنینی (EID50) داشت به هر جوجه به میزان 2 /ه میلی لیتر که در بافر فسفات نمکی رقیق شده بود روش چشمی - بینی تزریق شد.. پس از چالش علائم بالینی بیماری و مرگ و میر، روزانه برای مدت چهارده روز ثبت شد. طیوری که علائم تیپیک بالینی بیماری نیوکاسل را نشان دادند و یا مردند را به عنوان طیورغیر ایمن در نظر گرفته شدند .
آنالیزآماری
اطلاعات با استفاده از برنامه نرم افزاری SPSS18.0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و نتایج بشکل میانگین انحراف استاندارد SD ) ± Mean ) بیان شد. مقایسه میانگین های بدست آمده با استفاده از آزمون های uncan ,s multiple range بدست آمد میزان واریانسo.o5 P< به عنوان شاخص آماری مهم در نظر گرفته شد.
نتایج
اثر سیکلوفسفامید بر اوزان نسبی بورس فابریسیوس ، غده تیموس و طحال نسبت به وزن بدن طیور
نسبت اوزان بورس فابریسیوس، تیموس و طحال به وزن بدن طیور در روز های متفاوت پس از تحت تاثیر قراردادن سیکلوفسفامید از روز های هفتم تا سی وپنچ روزه گی محاسبه شد (جدول -1) . تفاوت چشمگیری بین اوزان نسبی اعضا ی ایمنی گروه کنترلی و گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند وجود نداشت o.o5) P> ) اما اوزان نسبی بورس فابریسیوس گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند در مقایسه با گروه کنترلی و گروهی که تحت تاثیر سیکلو فسفامید نبودند بشکل قابل توجهی کاهش داشت o.o5) P < ) و اوزان نسبی تیموس و طحال گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند از گرو هی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند از روز 7- 21 روزه گی بشکل قابل توجهی کمتربود. o.o5) P< ) . اختلافات از 35-28 روزه گی قابل توجه نبود . o.o5) P> ).
پاسخ آنتی بادی HI سرمی به ویروس نیوکاسل
درآزمون HI ، در گروه کنترل پاسخ به ویروس نیوکاسل دیده نشد. لیکن عیار آنتی بادی HI درگروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند ، در برابر واکسن زنده نیوکاسل بتدریج از روز هفتم پس از واکسینه شدن افرایش داشت و در روز 21 به حداکثر خود رسید. در طول آزمایش، عیار آنتی بادی سرمی HI در جوجه های تحت آزمایش پس از واکسینه شدن با گروهی که تحت تاثیر سیکلو فسفامید بودند بشکل قابل توجهی کمتر از گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند، شد. (P<0.01 )
پاسخ آنتی بادی IgAدر شستشوی محتویات نای و دئودنوم و صفرا
میزان آنتی بادی IgA در بیماری نیوکاسل در محتویات شستشوی شده نای و دئودنوم و صفرا در طیور تحت آزمایش پس از واکسینه شدن با واکسن زنده نیوکاسل در آزمون الیزا مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان آنتی بادی IgG در محتویات شسته شده نای در طیور واکسینه شده که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند سه روز پس از واکسینه شدن افزایش یافت و 28روز پس از واکسیناسیون به حداکثر میزان خود رسید.میزان آنتی بادی IgA هم در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند در تمام دوره آزمایش از نظر آماری کمتر از گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودندبود( P<0.01 ) از ر وز 3 الی 14 روز پس از واکسیناسیون میزان آنتی بادی IgA در محتویات شسته شده نای در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بسیار کم بود ولی بتدریج افزایش نشان داد و در روز 28 به حد ا کثر رسید که مشحصا" بیشتر از گروه کنترلی بود. P<0.05) ) پاسخ های واکسن نیوکاسل در محتویات شسته شده دئودنوم و صفرا هم مانند محتویات شسته شده نای بود.
سلول های IgA مثبت روده ای در( دئودنوم ژوژونوم و ایلئوم )
سلول های IgA مثبت روده ای بوسیله روش ایمینو هیستو شیمیائی مورد شناسائی قرار گرفتند و نتایج نشان داد که سلول های IgA مثبت اکثرا" در لایه لامینا تحت مخاطی و مرکز پرز های قسمت های مختلف روده مانند دئودنوم ژوژنوم و ایلوم قرار دارند. در دئودنوم و ژوژونوم و ایلئوم طیوری که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند در مقایسه با طیور تحت تاثیر، 28 روز پس از واکسیناسیون ، تعداد سلول هایIgA مثبت بیشتری مشاهده گردید.
ارتباط بین نتایج سرولوژیکی قبل از چالش و میزان مرگ ومیر پس از چالش
همانگونه که در جدول 2 نشان داده شده است طیور درگروه کنترل پس از چالش با ویروس حاد نیو کاسل، نشانی های بیماری را روز سوم نشان دادند و همه آنها تا روز ششم ، قبل از جالش مردند . میزان آنتی بادی IgA در نای و محتویات شسته شده دئودنوم گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند بشکل قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود ( 05/0 P<) و میزان عیار آنی بادی HI سرمی 26 بود. بدین ترتیب بیست طیور پس از چالش زنده ماندند و میزان ایمنی محافظت کننده 100% بود . درگروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید قرار داشتند قبل از چالش عیار آنتی بادی، HI سرمی 1 2 بودکه در مقایسه باگروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید نبودند بشکل قابل توجهی کمتر بود ( 05/0 P<). حال آنکه میزان آنتی بادی IgA در نای و دئودنوم بصورت قابل توجهی بیش از گروه کنترل بود ( 05/0 P<). وتعداد دوازده طیور در این گروه پس از چالش زنده ماندند و میزان ایمنی محافظت کننده آنها 60% بود. نتایج نشان داد که آنتی بادی IgA در سیستم تنفسی و گوارشی نقش مهمی را در مقاومت طیور در برابر چالش با ویروس حاد نیوکاسل ایفا می کند.
بحث
بورس فابریسیوس، تیموس و طحال از اعضای مهم ایمنی طیور میباشند. در تیموس و بورس فابریسیوس لمفوسیت های B , T از یکدیگر متمایز شده، رشد یافته و بالغ میشوند . طحال از اعضای مهمی است که در پاسخ ایمنی نقش داردNiu ,2004) ) بنابراین سطح ایمنی ارتباط نزدیکی با رشد و عمل این اعضای داردLiu , et al .,2006) ) اندیس در طیور نشان دهنده وضعییت رشد اعضای ایمنی است که از نسبت وزن اعضای ایمنی به وزن بدن حاصل می گرددDong et al .,2007) ). سیکلوفسفامید از مهار کننده های ایمنی رایجی است که از خونسازی در مغز استخوان ممانعت میکند و مانع سنتز لمفوسیت های B ,T شده و بویژه نسبت به لمفوسیت های B حساس است و عموما " اثرات سیکلوفسفامید در طیور بصورت بورسکتومی است (Elmubarak et al ., 1981 ) این ماده میتواند مانع رشد بورس فابریسیوس ، تکثیر لمفوسیت های B و کاهش ایمنی هوموال باشد . ) Hemendinger , Bloom ,1996 ).
ْGlick در سال 1986 گزارش کرد که تزریق سیکلوفسفامید در ابتدا سبب مهار لمفوسیت های وابسته به بورس شده و مانع ایمنی هومورال میشود و در طیور جوان ، تزریق سیکلوفسفامید می تواند سبب حذف پاسخ ایمنی هومورال در برابر بیماری های عفونی ویروسی بورس فابریسیوس ( IBDV) شده و همجنین موجب مهار پاسخ لمفوسیت ها و کاهش بارز مقدار لمفوسیت های خون محیطی میشود (Yeh et al .,2002 ). نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد وزن نسبی بورس فابریسیوس در طیوریکه تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند در مقایسه باگروهی که تحت تاثیر نبودند در طول 35 روز پس از درمان، کمتر بود( 01/0 P<) . اوزان نسبی تیموس و طحال گروه تحت تاثیر سیکلوفسفامید از گروهی که فاقد آن بودند در سن هفت الی بیست یک روزه گی کمتر بود ( 5 0/0 > P ) 1 نتایج جدول - 1گزارشات Corrier و همکاران در سال 1991 و Renolds و همکاران Maraqa در سال 1999 و Ei- Abasy و همکاران در سال 2004 مشا به است. در طیور با سرکوب ایمنی، مهار شدید ایمنی هومرال و کاهش قابل توجه عیار HI پس از واکسینه کردن با واکسن نیوکاسل مشاهده می گردد که این یافته ها در تائید گزارشات (Eskola and Toivane ,1974 : Lam and Hao,1987) است. پس از واکسینه کردن در روز بیست ویکم عیار آنتی بادی HI در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بسیار کمتر از گروهی بود که تحت تاثیر آن نبودند ( 1 0/0 P < ). نتایج حاصل نشان داد که سرکوب ایمنی بوسیله سیکلوفسغامید موفیقیت آمیز است بعبارت دیگر ایمنی هومورال بوسیله سیکلوفسفامید مهار شده و سلولهای بنیادی لمفوسیتی B قادر به تمایز و بالغ شدن در بورس فابریسیوس نیستند ( زیرا بورس فابریسیوس بشکل طبیعی قادر به رشد نیست و بشدت آتروفی یافته) و به سمت بافتهای لمفاوی محیطی مهاجرت میکنند و تعداد این لنفوسیت ها در بورس بصورت قابل توجهی کاهش مییابند. . در این بررسی میزان آنتی بادی IgA در محتویات شسته شده نای، دئودنوم و صفرا در گروه با سیکلوفسفامید بشدت کاهش یافت ( 5 0/0 P < ) علاوه بر آن نتایج حاصل از ایمینو هیستو شیمیائی نشان داد که سلولهای IgA مثبت در روز بیست و هشتم پس از واکسینه شدن در مخاط روده در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بشدت کمتر از گروهی که تحت تاثیر آن نبودند شد . این نتایج بیانگر آنست که سلولهای اجدادی IgA مثبت در بافتهای لمفوئیدی محیطی ممکن است از سلولهای وابسته به بورس باشند و غالبا از سلولهای بنیادی لمفوئیدی منشا ء گرفته و در مراحل نخست در بورس تمایز یافته و بالغ شده اند ، چنانچه بورس فابریسیوس دجار مهار ایمنی شود پاسخ ایمنی مخاطی هم دچار مهار و توقف خواهد شد. ایمنی هومورال سیستمتیک و ایمنی مخاطی بایکدیگر ارتباط دارند و مستقل ازیکدیگر نیستند( ذکر رفرانس ). مهار ایمنی بوسیله سیکلوفسفامید با دوام نبوده و در مرحله پایانی آزمایش گرچه بورس فابریسیوس طیور آسیب دیده و خونسازی مغز استخوان ممکن است ترمیم یابد و .بدین طریق لمفوسیت های جدید B که از مغز استخوان منشاء گرفته اند قادر به حرکت بوده و بسمت اندام های لمفوئیدی محیطی و بافتهای لمفوئیدی مخاطی میروند علاوه بر آن مراکز زایگر مخاطی لمفوسیت های B ممکن است تدریجا" در این مناطق تشکیل گردند. بنابراین ممکن است اثر مهارکنندگی سیکلوفسفامید در پاسخ ایمنی در مخاط در طول مرحله پایانی تکامل یابد. .میزان IgA در محتویات شسته شده نای دئودنوم و صفرا در گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند بصورت قابل توجهی از روز 14 پس از واکسینه کردن افزایش داشته و میزان مشخصی از سلولهای IgA مثبت در مخاط روده ای گروهی که تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند 28 روز پس از واکسینه کردن یافت شد علاوه بر آن 60% طیور یکه تحت تاثیر سیکلوفسفامید بودند پس از چالش با ویروس حاد نیو کاسل زنده ماندند . مطالعات قبلی ثابت کرد که سیکلوفسفامید در طیوری که تازه از تخم خارج شده اند تاثیر کمی بر روی تیموس دارد و توانائی تولید ایمنی زائی سلولی را هم دارد ( Linna et al., 1972 : Kowalski et al .,1978 ( بنابراین ایمنی سلولی در طیور تحت تاثیر سیکلوفسفامید در روز 28 پس از واکسینه کردن بیشتر ترمیم یافته و بشکل قابل توجهی از پرندگان غیر متاثر متفاوت نمیباشد . نتایج بالا ببصورت کامل ثابت کرد که پاسخ ایمنی مخاطی نقش مهمی را بر علیه عفونت نیوکاسل بازی میکند." این بررسی نشان داد که اولا* پاسخ ایمنی مخاطی در طیوری که تازه از تخم خارج شده ا ند و با واکسن زنده نیوکاسل واکسینه شده اند تحت تاثیر سیکلوفسفامید بشدت آسیب دیده و در ضمن قسمتی از اثرسرکوب ایمنی مخاطی به وسیله سیکلوفسفامید از روز 21 پس از واکسینه شدن ب ترمیم یافته و علاوه بر آن نقش ایمنی مخاطی در مقاومت به ویروس حاد نیوکاسل بوسیله آزمون چالش هم مشخص شد. و این یافته ها درک بهتری از پاسخ ایمنی مخاطی را در برابر واکسن نیوکاسل ارائه میکند و پیشنهاد میدهد که ایمنی مخاطی نقش ارزندهای بر علیه عفونت بیماری ویروسی نیوکاسل دارد.
References
Al-Garib SO, ALJ Gielkens, E Gruys and G Kochi, 2003.Review of Newcastle disease virus with particular references to immunity and vaccination. World’s
Poult Sci J, 59: 185-200.
Awan MA, MJ Otte and AD James, 1994. The epidemiology of Newcastle disease in rural poultry: a review. Avian Pathol, 23: 405-423
Beard CW and RP Hanson, 2003. Newcastle disease.Pages 452-470 in Diseases of Poultry. MS Hofstad,
JH Barnes, BW Calnek, WM Reid, HW Yoder, eds.Iowa State University Press, Ames, IA.Corrier DE, MH Elissalde, RL Ziprin and JR DeLoach,
1991. Effect of immunosuppression with cyclophosphamide, cyclosporin, odexamrthasone on salmonella colonization of broiler chicks. Avain Dis, 35: 40-45.
Dong XF, SK Wang, RN Sa, Q Zhang and JM Tong, 2007. Effect of immunosuppressant cyclophosphamide on performance and incretion in broiler.
Acta Vet Zootechnica Sinica, 38: 993-998.
Ei-Abasy M, M Motobu, K Nakamura, K Koge, T Onodera, O Vainio, P Toivanen and Y Hirota, 2004.Preventive and therapeutic effects of sugar cane
extract on cyclophosphamide induced immunosuppression in chickens. Int
Immunopharmacol, 4:983-990.
Elmubarak AK, JM Sharma, LF Lee and VL Sanger, 1981. Suppression of immunologic function and degeneration of lymphoid organs in cyclophosphamide-treated turkeys. Am J Vet Res, 42: 2122-2128.
Erf G F, 2004. Cell-mediated immunity in poultry. Poult Sci, 83: 580-590.
Eskola J and P Toivane, 1974. Effect of in ovo treatment with cyclophosphamide on lymphoid system in chicken. Cellular Immunol, 13: 459-471
Fabienne Rauw, Yannick Gardin, Vilmos Palya, Steven Van Borm, Martine Gonze, Sophie Lemaire, Thierry Van 2009) Humoral, cell-mediated and mucosal immunity induced by oculo-nasal vaccination of one-day-old SPF and conventional layer chicks with two different live Newcastle disease vaccines Vaccine Volume: 27, Issue: 27, Pages: 3631-3642
Glick B, 1986. Avian immune capacity and bone marrow cellularity after in ovo treatment with cyclophosphamide. Int Arch Allergy Appl Immunol, 79: 95-100.
Hemendinger RA and SE Bloom, 1996. Selective mitomycin C & cyclophosphamide induction of apoptosis in differentiating B lymphocytes compared to T lymphocytes in vivo. Immunopharmacol, 35: 71-82.
Jayawardane GWL and PB Spradbrow, 1995. Mucosal immunity in chickens vaccinated with the V4 strain of Newcastle disease virus. Vet Microbiol 46: 69-77.
Kowalski WJ, M Malkinson, GA Leslie and PA Small, 1978. The secretory immunological system of the fowl: VI. The effect of chemical bursectomy on
immunoglobulin concentration in tears. Immunol, 34: 663-667.
Lam KM and Q Hao, 1987. Vaccination of cyclophosphamide-treated chickens against Newcastle disease virus infection. Vet Microbiol, 15: 41-48.
Lambrecht B, M Gonze, G Meulemans and T Van Den Berg, 2004. Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken interferon-gamma in response to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimulation. Avian Pathol, 33: 343-350.
Linna TJ, D Frommel and RA Good, 1972. Effects of early cyclophosphamide treatment on the development of lymphoid organs and immunological functions in the chicken. Int Arch Allergy appl Immunol, 42: 20.
Liu YF, JS Ma, YJ Huang, XL Huang and JC Liao, 2006. Effects of glutamine on development of immuneorgans and immune functions in broilers. Chin J Vet
Sci, 26: 567-569.
Markowski-Grimsrud CJ and KA Schat, 2003. Infection with chicken anaemia virus impairs the generation of pathogen-specific cytotoxic T lymphocytes.
Immunol, 109: 283-294.
Niu ZX, 2004. The immune system. In: VeterinaryImmunology (Cui ZZ, Cui BA ， eds). China Agriculture Press，Beijing, China, pp: 13-18.
Nowak JS, O Vainio and O Lassila, 1990. In vitro organ culture of embryonic bursa of Fabricius. Dev Comp Immunol, 14: 239-246.
Oliveira CA, LF Telles, AG Oliveira, E Kalapothakis, H Gonçalves - Dornelas and GA Mahecha, 2006. Expression of different classes of immunoglobulin in intraepithelial plasma cells of the Harderian gland of domestic ducks Anas platyrhynchos. Vet Immunol Immunopathol,113: 257-266.
Ratcliffe MJH, 2006. Antibodies, immunoglobulin genes and the bursa of Fabricius in chicken B cell development. Dev Comp Immunol, 30: 101-118.
Rauw F, Y Gardin, V Palya, S Van Borm, M Gonze, S ,Lemaire, T Van Den Berg and B Lambrecht, 2009. Humoral, cell mediated and mucosal immunity induced by oculo-nasal vaccination of one day-old SPF and conventional layer chicks with two different live Newcastle Disease vaccines. Vaccine, 27: 3631-3642.
Reynolds DL and AD Maraqa, 1999. A technique for inducing B-cell ablation in chickens by in ovo injection of cyclophosphamide. Avian Dis, 43: 367-375.
Reynolds DL and AD Maraqa, 2000. Protective immunity against Newcastle Disease: the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides.Avian Dis, 44: 138-44.
Scott TR, 2004. Our current understanding of humoral immunity of poultry. Poult Sci, 83: 574-579.
Sharma JM, IJ Kim, S Rautenschlein and HY Yeh, 2000.Infectious bursa disease virus of chickens:pathogenesis and immunosuppression. Dev Comp Immunol, 24: 223-235.
Takada A and H Kida, 1996. Protective immune response of chickens against Newcastle disease, induced by the intranasal vaccination with inactivated virus. Vet Microbiol, 50: 17-25.
Tizard I, 2002. The avian antibody resp Exot onse. Semin Avianic Pet Med, 11: 2-14.
Van Boven M, A Bouma, THF Fabri, E Katsma, L Hartog and G Koch, 2008. Herd immunity to Newcastle. disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol,
37: 1-5.
Weill, JC and C A Reynaud, 1987. The chicken B cell compartment. Science, 238:1094-1098.
Yeh HY, S Rautenschlein and JM Sharma, 2002.Protective immunity against infectious bursal disease virus in chickens in the absence of virus-specific antibodies. Vet Immunol Immunopathol, 89: 149-158.
